基于scx-rplc的全二维微柱液相色谱分离平台的构建.docx

基于scx-rplc的全二维微柱液相色谱分离平台的构建 多段萃取铬（mdlc）具有峰容量大、分辨率高、分离能力强等优点。近年来，它被广泛应用于复杂的系统（如蛋白质组、中药和聚合物）的分离分析中。MDLC通常选用适当的切换模式将具有不同分离机理的色谱柱进行耦联。根据不同的研究对象,目前已构建了离子交换色谱-反相色谱(IEC-RPLC)、体积排阻色谱-反相色谱(SEC-RPLC)、离子交换色谱-体积排阻色谱(IEC-SEC)、毛细管等点聚焦-反相色谱(CIEF-RPLC)、正相色谱-反相色谱(NP-RPLC)等多维液相分离平台。 随着人类基因组测序的完成,生命科学进入了后基因时代,蛋白质组学成为重要的研究内容。在蛋白质组学的研究中,通常采用Shotgun技术对蛋白质的酶解产物进行分离和鉴定,即第一维采用强阳离子交换(SCX)柱对样品进行分级。流出组分经一定的切换接口收集后,转移至第二维C18RPLC柱进行分离,最后经质谱检测鉴定。目前的二维液相色谱(2D-HPLC)分离平台通常采用多套HPLC泵和多个切换阀来构建。系统较为繁琐,所需设备较多。随后,Yates等建立了多维蛋白识别(MUPIT)技术,即将SCX填料和RPLC填料填充到一个色谱柱中,实现正交分离。这种方法不需要进行阀切换,两维色谱柱之间不存在死体积,且只需一个四元梯度泵即可完成分离。然而,采用该方法无法消除高盐对质谱的影响。曾嵘等在此基础上发展了组合多维液相色谱(IMDL)技术,通过采用不同pH条件的低盐缓冲液作为第一维的洗脱液消除了盐对质谱的影响。本文采用自动进样器和1套二元梯度泵构建了以SCX-RPLC为分离模式的在线全二维微柱液相色谱分离平台。采用该方法不仅可以简化系统构成,而且可以解决样品的脱盐问题。通过对5种标准蛋白酶解产物的分离,该系统显示出很好的分离性能。研究结果表明,该平台有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用。 1 实验部分 1.1 其它试剂组成 二维微柱液相色谱系统(Michrom Bioresources Inc,美国);紫外检测器(Knauer,德国);自动进样器(Flowspek,荷兰);色谱柱:Magic C18反相色谱柱(50 mm×0.3 mm i.d., 5 μm,Michrom Bioresources Inc,美国)、乙腈(色谱纯,Merck公司);胰蛋白酶(trypsin)、二硫苏糖醇(DDT)、碘乙酰胺(IAA)、β-卵球蛋白(β-lactoglobulin)、细胞色素C(cytochrome)、血红蛋白(hemoglobulin)、肌红蛋白(myglobulin)均购于Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA,上海长阳制药厂)。其它试剂均为国产分析纯。 色谱柱及流动相组成:第一维采用SCX柱(8 mm×1 mm i.d.,Michrom Bioresources Inc, 美国);流动相,采用0、25、50、80、100、200、300、400、500、800、1 000 mmol/L的醋酸铵-甲酸缓冲溶液(pH 3.5);流速为50 μL/min。捕集柱为C8预柱(2 mm×0.5 mm i.d., Michrom Bioresources Inc, 美国)。第二维采用C18RPLC柱;流动相A为含有 0.1%(体积分数)甲酸、0.005%(体积分数)七氟丁酸、2%(体积分数)乙腈的水溶液,流动相B为含有 0.1%甲酸、0.005%七氟丁酸、98%(体积分数)的乙腈水溶液;流速为5 μL/min;紫外检测波长为205 nm。 1.2 dtt法 精确称取牛血清白蛋白、β-卵球蛋白、细胞色素C、血红蛋白和肌红蛋白各1 mg,分别用NH4HCO3(50 mmol/L,pH 8.0)溶液配至1 g/L。各取200 μL混合作为标准蛋白混合溶液。在混合溶液中加入20 μL 50 mmol/L DTT溶液后,在56 ℃水浴锅中反应30 min。加入20 μL 500 mmol/L IAA溶液,室温下暗处静置40 min。再加入适量的胰蛋白酶溶液,混匀后将其放入水浴锅中37 ℃反应18 h取出,并加入适量的甲酸终止酶解反应。然后将其置于截流相对分子质量为10 ku的超滤膜中,在12 000 r/min下离心以除去没有反应完的蛋白和酶,放入超低温冰箱中冻存待用。 2 结果与讨论 2.1 c8预柱分离 采用自动进样器和1套二元梯度泵系统构建了全二维微柱液相色谱分离平台,如图1所示。该系统通过连有C8预柱的十通阀将SCX柱和C18RPLC柱连接起来。在第一维分离中,通过自动进样器将不同浓度的盐溶液以台阶梯度输送至离子交换SCX柱上,实现肽段的分级洗脱。分级洗脱下的肽段再进入C8预柱,经富集、除盐后,再被导入进入第二维C18RPLC反相色谱柱上,通过线