PCR、载体构建及转化ppt课件.pptxVIP

PCR、 载体构建及转化 Southem杂交- →检测转基因生物染色体的 DNA 上是否插入了目的基因 (DNA-DNA 分子杂交) Northem 杂交 →检测转基因生物体内的目的基因是否转录出了mRNA (DNA-RNA 分子杂交) Westem 杂交 →检测转基因生物体内的目的基因是否翻译成蛋白质 (抗原一抗体杂交) 运载体 目 的 基 因 4----同一种限制酶切割-- 连 接 酶 连 接 - - 植物 动物 微生物 受体细胞 受体细胞 受体细胞 受 体 细 胞 显微注射法 花粉管通道法 基因枪法 农杆菌转化法 DNA 限制酶切割， 一定大小范围DNA 基因文库 包括 基因组文库 cDNA 文库 人工合成 个体水平检测 →确定目的基因表达产物的生物学活性是否与天然产品相同 终止子 抗生素 抗性基因 mRNA 逆转录 cDNA 目的基因导入 受体细胞 目的基因的 检测与鉴定 构建基因 表达载体 基 因 表 达 载 体 分 子 水 平 检 测 感受 态细 胞转 化法 启动子 插入基因 获取目的基因 生物材料 复制原点 表达载体 PCR 1.目的基因分离(PCR) 2.载体构建 3.转化 3 1.目的基因分离(PCR) 4 目的基因分离(PCR) PCR 之 歌 There was a time when to amplify DNA,从前你要扩增DNA, You had to grow tons and tons oftiny 总有培养大批细胞的重任要你背。 . along came a guy named Dr.Kary这时有个家伙叫Kary Mullis博士的， i ou can amplify in vitro just as welí他钻出来说体外合成也一样0K! t plate with a buffer 只要把你的模板混上缓冲液，再加些 Nucleotides and polymerases,too. 引物，还有核苷酸和聚合酶。 l i a a ng. 变性，退火，和延伸。 ngand xtendi ti e h n t a wha ling, g e amazin ng,ann s r it tu l a e n W De primers our tem e y som mix and Jus s y , d lli a u S M en lls 加热-冷却-加热太神奇了! 当你想要检测突变，来啊做PCR吧! 当你想要基因重组，来啊做PCR吧! 当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊 做 PCR吧 ! 当你想要侦破大案，来啊做PCR吧! cooling and heating will do. PCR,when you need to detect mutations. PCR,when you need to recombine. PCR,when you need to find out who the daddy is. PCR,when you need to solve a crime 5 多聚酶链式反应 (PCR:Polymerase Chain Reaction) PCR 是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA 体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。 6 PCR:Polymerase Chain Reaction 30-40 cycles of 3 steps: Step 1:denaturation 1 minut 94℃ )’ ) 3 3 5 川3 3 Step 2:annealing 5 45 seconds 54 ℃ TTTT3 forward and reverse 5 primers !!! 34 [|||| |[]3 5 Step 3:extension 5m 二 J )r³ U || 一 山 山 5 2 minutes 72 ℃ only dNTPs (Andy Vierstraete 1999) PCR技术的原理 7 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物 退火和反应延伸三个步骤完成的。图