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鸭疫里默氏杆菌病的诊断与治疗 姚梅杆菌（ra）是引起鸭流鼻涕病的病原体，可以导致各种鸟类，如鸭、鹅、鸡和其他疾病。鸭疫里默氏菌病是严重危害湖北省养鸭业的重要细菌性疾病之一,流行广泛,死亡率可达10%~30%,给湖北养鸭地区造成了巨大的经济损失。该病呈急性或慢性经过,临床表现精神沉郁、流泪和流鼻涕、轻度咳嗽和喷嚏、排绿色稀粪、共济失调、头颈震颤和昏迷。感染鸭消瘦,淘汰率高,幸存鸭生长迟缓。其病理解剖特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。Riemer于1904年最早报道了由该菌感染引起鹅的发病。1982年,郭玉璞等首次发现此病以来,在全国许多省区相继有此病发生的报道。本研究以湖北省某规模化鸭场的20日龄有疑似鸭疫里默氏菌病的病鸭为对象,无菌采集组织病料,进行鸭疫里默氏菌的分离、鉴定,并对分离株的生物学特性进行了初步的研究。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 从20日龄病死鸭采集心血、肝、脑和脾脏组织病料,备用;胰酶消化大豆肉汤(TSB)、大豆蛋白琼脂(TSA,含5%小牛血清)和麦康凯培养基购自中国兽医药品监察所;核酸抽提试剂盒(上海华舜生物技术有限公司);非免健康雏鸭购自武汉春江鸭场;1,2型标准血清由中国农业大学苏敬良博士惠赠。 1.2 sa和麦康凯平板 分别取鸭肝、脑、心血等病料组织接种于TSA(含5%小牛血清)和麦康凯平板上。置于烛缸中,37℃培养24 h,然后挑选单个菌落进行纯化培养,并进行革兰氏染色。 1.3 细菌凝胶实验 取一滴生理盐水于玻片上,用接种环挑单个纯培养菌落于生理盐水中吹打混匀,与5μL标准血清进行玻片凝集实验。 1.4 生物化学 将纯培养物分别进行微量单糖发酵实验、M.R、V-P、H2S、硝酸盐还原、明胶液化、尿素酶、靛基质和触酶实验。 1.5 pcr检测和序列分析 1.5.1 小鼠基因组dna的提取 挑取TSA(含5%小牛血清)平板上单个菌落,接种于含5%小牛血清的TSB,37℃,180 r/min,振荡培养20 h,离心取菌泥,用小量液体样品核酸抽提试剂盒提取各菌株的基因组DNA,作为PCR的模板。 1.5.2 植物基合成品2.5-cactctg-3,5-tg 引物序列来自文献,对16S rRNA基因进行检测,上游引物序列:5′-CAGCT-TAACTGTAGAACTGC-3′,下游引物序列:5′-TC-GAGATTTGCATCACTTCG-3′,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.5.3 pcr反应taq酶 分别以细菌的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。反应体系(50μL):10×Buffer 5μL,上下游引物各20 pmol,dNTP各10nmol,2.5 U的Taq酶,模板1μL,加水补至50μL。扩增反应程序:94℃5 min;94℃50 s,55℃50 s,72℃1 min,30个循环;72℃7 min。 1.5.4 pcr产物的测量序列 PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 1.6 回复突变试验 对其中1株分离菌株经纯化后,接种于TSB培养液,37℃振荡培养24 h,纯粹检验。经细菌计数,将菌液调节至活菌含量约为1.5×1010CFU/mL,对4周龄左右的健康雏鸭进行颈背部皮下注射新鲜培养液,剂量为0.2 mL/只,24 h后观察症状,并对死亡鸭进行剖检。 2 结果与分析 2.1 麦康凯琼物水湿法 在TSA(含5%小牛血清)平板上生长出直径为1~2 mm,凸起,边缘整齐,透明有光泽呈奶油状的菌落,用斜射光观察有虹光;麦康凯琼脂上不生长。共分离到8株菌株,革兰氏染色呈阴性,短小杆菌。 2.2 凝集实验 用标准的1、2型阳性血清进行玻片凝集实验,8株分离菌均与1型阳性血清出现明显的凝集反应,与2型阳性血清无任何反应。 2.3 m.r、p试验阴性 生化试验结果表明,分离菌株不能发酵多种碳水化合物(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖);M.R、V-P试验阴性;不产生硫化氢;不能还原硝酸盐、液化明胶和分解尿素,靛基质试验阴性,触酶反应阳性。 2.4 pcr检测结果 实验结果见下图,8株分离菌的16S rRNA PCR结果均为阳性(见图1)。测序结果经NCBI Blast比对,分离菌株的扩增序列与鸭疫里默氏菌的16S rRNA基因同源性达98%以上。 2.5 死亡鸭的临床病理 雏鸭在人工感染分离的菌株后,24 h后出现明显的症状,缩脖、腿发软,48 h后有些病鸭表现为仰卧、双腿划动呈游泳状,临死前出现典型的神经症状。48 h内死亡60%,96 h死亡80%,一周以后有一只试验鸭存活。死亡鸭的大体病变主要以心包炎、肝周炎和气囊炎为主;能从所有死亡鸭的肝、心血和脑中分离出与接种细菌培养特性相同的细菌,且与1型阳性血清凝集反应呈阳性。 3 鸭疫里默氏菌病的