石蜡切片技术.pptx

石蜡切片技术 一、显微切片技术产生得原因光学显微镜发展到一定程度之后,渴望知道细胞结构由于组织太厚,光线很难穿过压片可使组织变薄,但引起变形、易位,除核外,看不到其她结构,因此需要切片变薄。因细胞水多,太软,无法切片 鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代,变硬,能直接切片得方法,最广泛使用得就就是石蜡切片技术 二、石蜡切片技术得优点 为什么选择这一技术呢？主要因为她有以下优点:便于推广、经济、适用、简便。经济,价格低,可反复使用;技术难度不大,容易掌握,但要精通也不容易;设备要求不高 ;可长期保存;染色容易,而且都能被染色,形成好得反差和好得选择性。 三、石蜡切片得主要过程 杀生(取材)——固定——冲洗——脱水——保存——透明——石蜡透入——包埋——切片——复水——染色——脱水——封藏——观察保存(一)取材、固定、洗涤、脱水(二)透明、透蜡、包埋(三)切片、贴片(四)染色、封藏 (一)取材杀生(动物)1、目得:动物必须杀生,然后取出所需组织2、方法:一般采用乙醚(氯仿)麻醉后解剖,取出所需组织。3、注意事项:性别合适麻醉前动物生活正常,以免影响其代谢活动,进而影响细胞结构取材部位要准, 速度快 (一)取材 1、目得:得到所需要得组织 2、方法:a、用剪刀剪下组织 b、冲洗动物组织,动物(生理盐水、糜蛋白酶溶液)植物(缓冲液或水)冲洗干净,防止失水,避免压挤损伤,用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面得血、粘液和赃物。 c、切成小块 3注意事项:要准要快避免损伤(方向,刀要快,不能挤压)植物取材:用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常,不要因缺水、营养和温度光照发生明显改变,影响细胞结构,同时发育程度、部位要准。 (二)固定 1、目得: 为了使取样得细胞在形态结构和成分方面保持与生活得状态一样,就必须迅速杀死细胞避免失水变形,自溶破坏结构等。 固定液得选择:快;不溶解;不收缩膨胀;软硬适中;增加折光度;增加染色能力;长期保存等7项。 2、方法(1)固定剂得种类:一般采用化学固定 单纯固定:只用一种试剂固定: 混合固定:用两种或两种以上得试剂混合在一起进行固定如: 单纯固定:福尔马林formalin:10%得甲醛(37%——40%)醋酸(0、3%~5%)苦味酸(饱和溶液,三硝基苯酚)铬酸0、5~1%锇酸1~2%升汞(氯化汞饱和水溶液约7%) 混合固定:用两种或两种以上得试剂混合在一起进行固定如:卡诺氏固定液 酒精:冰醋酸(3:1) 酒精:冰醋酸:氯仿(6:1:3)适用于动植物一般组织细胞。FAA 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬、 但单细胞及丝状藻类除外,也不适于细胞学研究 11大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流 卡诺氏固定液(Carnoys Fluid) 适用于一般植物组织和细胞得固定,常用于根尖,花药压片及子房石蜡切片等、有极快得渗透力,根尖材料固定15—20min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超过24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止;如果材料不马上用,需转入70%酒精中保存、固定液得重要特性就是能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构得完整性,还要能够增强染色体得嗜碱性,达到优良染色效果。 　　 F、A、A固定液 又称标准固定液,万能固定液、适用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片、在植物形态解剖研究上应用极广;FAA固定液得优点在于:兼有保存剂作用,冰醋酸既能抵消酒精和甲醛对组织得收缩作用又就是细胞核得优良固定剂,沉淀核蛋白,且对免疫组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强大得固定效能,较之单纯固定更科学更快更好！对染色体得观察效果较差、 (2)固定方法静置固定:将组织块放入盛有固定液得小得称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中,在室温或低温(0~4℃)固定一段时间,不断摇动能增加固定效果,植物和动物经常使用这种方法。灌注固定:常用于动物,将固定液通过已麻醉得动物血管中,让血液流动,固定所需细胞,该方法有点,固定均匀,不出现自溶现象,但较繁琐。 3、固定时应注意得事项固定条件得选择:种类、浓度、温度和时间固定要快否则会自溶:组织快,不能太多,否则固定不透: (三)冲洗 1、冲洗得目得 除去固定剂,主要就是防止固定得毒害作用,固定时间太长,组织收缩变脆。 2、冲洗得方法 ⑴ 冲洗液随固定液而定,冲洗得选择:不形变提取,不反应,有效除去固定液。①固定液为水溶液时,以水或低浓度得酒精冲洗;② 固定液就是酒精多以不同浓度得酒精冲洗,以