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基因工程制药工艺 *3.1 基因工程制药微生物表达系统 *基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。 *一 大肠杆菌表达系统1 大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。 *2 生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。 *3 质粒载体复制起始点选择标记多克隆位点 *质粒类型严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101；松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1；克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因；测序质粒：用于基因测序；整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合；穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在；表达质粒：能表达基因产物 *4 产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体；可溶性蛋白质：存在于细胞质；周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。 *5 优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。 *6 应用大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶栓酶类：rPA白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。 *二 酵母表达系统1 形态特征细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。 *2 生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因。 *3 优点与不足优点五种类型的载体，——安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。 *4 应用1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素2种乙肝疫苗等。8种产品 *3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术 *一 工程菌构建流程目标基因克隆表达载体构建遗传转化与筛选工程菌PCR、文库、化学合成酶切、连接外源基因导入与培养 *二 表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定 *三 基因工程菌的建立过程适宜宿主菌的转化筛选鉴定，遗传稳定性等。目标获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。 *表达筛选与产物鉴定不同菌种的表达筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式和存在场所的鉴定表达部位胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白表达产物结构与活性鉴定电泳，SDS－PAGE，等电点电泳免疫杂交，末端测序，质谱分析分析与目标产物的同一性 *3.3 基因工程菌的发酵培养与控制 *一 培养基组成与控制碳源氮源无机盐选择剂诱导物 *1 碳源大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源；酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。 *2 氮源直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸为氮源 *3、无机盐磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态基因工