快速有效筛选目标微生物的新方法.pptVIP

宏基因组学 第一节 什么是宏基因组学 第二节 宏基因组学技术流程 第三节 宏基因组学的应用 本文档共25页；当前第1页；编辑于星期二\13点41分 第一节 什么是宏基因组学 背景知识： 迄今，人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1％ 的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的，对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物，早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路，1998年，ARIAD pharmaceutical公司的科学家Handelsman等首次提出宏基因组的概念。 本文档共25页；当前第2页；编辑于星期二\13点41分 宏基因组(the genomes of the total micro biota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。 宏基因组学( metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法，也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。 它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能，为充分认识和开发利用非培养微生物，并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源提供了可能 本文档共25页；当前第3页；编辑于星期二\13点41分 第二节 宏基因组学技术流程 从环境中提取宏基因组DNA； 用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片段并连接到合适的载体上； 转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库； 宏基因组文库筛选。 本文档共25页；当前第4页；编辑于星期二\13点41分 一、环境样品DNA提取 提取步骤通常需要满足两个条件： ①尽可能提取样品所有微生物的基因， ②保持片段的完整和纯度。 目前所开发的DNA提取方法有两种： 细胞提取法和直接裂解法 本文档共25页；当前第5页；编辑于星期二\13点41分 直接裂解法：物理法：冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法 化学法：常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等 酶裂解法 依据提取样品总DNA前是否分离细胞，可以分为原位裂解法和异位裂解法。 本文档共25页；当前第6页；编辑于星期二\13点41分 1、原位裂解法（直接提取法） 原位裂解法是在环境样品中加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解然后从样品中直接提取DNA并纯化的方法。 优缺点：该法提取的DNA产量较高，操作容易、成本低，但纯度低，腐植酸等污染严重，往往还需要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作的需要，此外，由于机械剪切作用较强，提得的DNA片段长度有限（1-50Kb），常适用于构建小片段插人文库(以质粒和噬菌体为载体)的DNA提取。 本文档共25页；当前第7页；编辑于星期二\13点41分 2、异位裂解法 异位裂解法是先把微生物细胞从环境样品中分离出来，再从微生物细胞提取DNA并纯化。 优缺点：所得的DNA纯度较高，但DNA产量及所包含的基因组信息的广泛性不及直接提取法并且操作繁琐、成本高、得率低。间接提取法提得的DNA片段长度相对较长（20-500Kb），适合构建黏粒（cosmid）文库和细菌人工染色体（BAC）文库。 本文档共25页；当前第8页；编辑于星期二\13点41分 二、宏基因组文库构建 本文档共25页；当前第9页；编辑于星期二\13点41分 1、载体系统选择 常用的克隆载体有: 质粒载体(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10 kb； Cosmid(黏粒载体，如pWE15)，插入片段30～45kb； BAC(细菌人工染色体，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。 本文档共25页；当前第10页；编辑于星期二\13点41分 选择合适的载体系统，应考虑以下因素 : 所提DNA的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。 如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子。而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则适宜构建Cosmid、Fosmid或BAC文库，从而筛选由较大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征