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另一种改造策略： 改造腺病毒的基因结构,置换上针对癌细胞的特异型启动子。如装上AFP启动子,使载体特异性感染肝癌细胞。 提高腺病毒载体的靶向特异性 本文档共44页；当前第30页；编辑于星期一\20点2分 宿主的免疫反应仍然是获得转基因长期表达和重复使用腺病毒载体的主要障碍。大量研究已证实,具有感染性的腺病毒载体本身就足以引起免疫反应。 更为“复杂”的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体,在其构建时去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因。所谓的“空壳”载体起先只保留了ＩＴＲ和包装信号,且在产生中需要辅助病毒和合适的互补包装细胞,更需要进一步的纯化。 第三代腺病毒载体 本文档共44页；当前第31页；编辑于星期一\20点2分 第三代新型重组腺病毒载体删除病毒基因中所有开放阅读框,仅含有必要的顺式元件(即ITR和邻近的包装信号序列) ,需要在辅助病毒存在情况下,在包装细胞中繁殖,其安全性很高。 第三代腺病毒载体不但可容纳较大的外源基因(32kb) ,而且较容易获得高滴度( 109pfu /ml) 。 第三代新型重组腺病毒载体 本文档共44页；当前第32页；编辑于星期一\20点2分 腺病毒表达系统详解演示文稿 本文档共44页；当前第1页；编辑于星期一\20点2分 （优选）腺病毒表达系统 本文档共44页；当前第2页；编辑于星期一\20点2分 病毒表达系统的特点 高转染效率 高蛋白表达水平 对转染效率很低的细胞进行高效转染 (原代细胞等) 稳定,可遗传的表达 (逆转录病毒) 可控制拷贝数 本文档共44页；当前第3页；编辑于星期一\20点2分 如何选择合适的病毒表达载体？ 可适用的宿主细胞类型 选择标记 插入片段的大小 调控元件 报告基因 本文档共44页；当前第4页；编辑于星期一\20点2分 病毒表达载体的用途 基因治疗 1990年French等把腺嘌呤脱氨酶基因导入到一名4岁小女孩的T淋巴细胞中治疗了腺嘌呤脱氨酶基因缺失病,开创了人类利用人体基因治疗疾病的先例。 1992年复旦大学薛京伦等首次把人凝血因子Ⅸ基因成功用于治疗血友病。 2005年第一个批准上市的基因治疗制品Adv-P53在中国上市。 病毒载体疫苗 本文档共44页；当前第5页；编辑于星期一\20点2分 重组腺病毒的作用 在哺乳动物细胞中，AdV已被成功应用于表达各种病毒和细胞的基因，腺病毒表达载体系统表达出蛋白的生物化学特性，可用于商业价值的开发，它可用来生产亚单位疫苗，和新型诊断试剂盒的开发。 AdV可以通过转染细胞来表达蛋白，除基因治疗的相关实验外还可用做体内特性研究。 本文档共44页；当前第6页；编辑于星期一\20点2分 被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓 纯化腺病毒的电子显微照片 被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠纹状体的切片 本文档共44页；当前第7页；编辑于星期一\20点2分 用AdV转染基因的优点 速度快，简单，不需要任何特殊的装备。 相对其它方法，它非常容易被接受。事实上，这种感染后细胞生存率几乎为100%。因此，AdV有向细胞内转染遗传物质而忽视毒性作用的能力。 许多细胞类型均可被转染。 感染后的数小时，基因表达便可被分析。 刺激后，可有一种以上的基因被同时表达。 本文档共44页；当前第8页；编辑于星期一\20点2分 腺病毒颗粒比较稳定,病毒基因组较少发生重排。插入外源基因的病毒基因组在连续传代中一般保持不变。 腺病毒基因组较易操作。 制备大量的腺病毒较为容易。 可感染分裂细胞和非分裂细胞。rAds可转导肺细胞、肝细胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等。 重组腺病毒表达系统 本文档共44页；当前第9页；编辑于星期一\20点2分 重组腺病毒表达系统 通过对本体蛋白的同样的翻译后的修饰，在细胞中表达真核蛋白。 一系列腺病毒转换因素允许产生高水平的异种蛋白。重组蛋白代表了整个细胞蛋白的最丰富的多肽（20%-30%）。 在较好的条件下，表达系统在数升的293细胞悬浮培养液中可以按比例地增加，产量可达90mg/L。 本文档共44页；当前第10页；编辑于星期一\20点2分 腺病毒表达系统 本文档共44页；当前第11页；编辑于星期一\20点2分 腺病毒属于无包膜病毒,外壳由240个六邻体和12个五邻体构成二十面体结构,内部有约36kb的线性双链基因组,属于DNA病毒。外壳的五邻体分别位于二十面体结构的顶角、均有一个纤突蛋白(fiber)突起与其相连,腺病毒的组织亲合性与纤维蛋白头部密切相关。 腺病毒的特性 本文档共44页；当前第12页；编辑于星期一\20点2分 腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白,分为早期表达和晚期表达。早期表达的蛋白是功能蛋白、晚