第三章蛋白质研究技术().pptVIP

离子交换层析 收集 阳离子 洗脱 阴离子 本文档共78页；当前第31页；编辑于星期三\10点25分 阳离子交换剂分离氨基酸 本文档共78页；当前第32页；编辑于星期三\10点25分 ③.亲和层析（affinity chromatography） 亲和层析：利用蛋白质分子与配体间特异、可逆的亲和作用，而进行分离的一种层析技术。 ?配体的偶联：抑制剂、活化剂、辅酶（辅基）、底物及类似物、抗体、受体等（如外源凝集素、金属离子等）与固定相偶联； ?上柱结合：与配体特异结合的蛋白质被滞留在层析柱中，其他(杂质)成分流出； ?洗脱：加入过量的配体、配体类似物或改变洗脱液浓度（或 pH）使结合的蛋白质被顶替下来。 本文档共78页；当前第33页；编辑于星期三\10点25分 杂质 溶液 偶联 　　　　亲和层析的基本要素 本文档共78页；当前第34页；编辑于星期三\10点25分 亲和层析 本文档共78页；当前第35页；编辑于星期三\10点25分 金属螯合层析法（MCAE） 固定相 本文档共78页；当前第36页；编辑于星期三\10点25分 4.膜蛋白的分离方法 　膜蛋白：指与生物膜镶嵌、结合或附着的一系列蛋白质。 　2004年蛋白质数据库提交的3D物已超过22,000个，但几乎都 为可溶性蛋白，膜蛋白不到1%。（Uniprot数据库） ?膜蛋白是一种难以分离和纯化的蛋白质。从质膜中分离时，暴露的疏水区互作，易引起蛋白质聚集、沉淀，不易获得结晶。 ?去污剂（detergents）是一种两亲分子，能嵌入到磷脂双层（phospholipid bilayers）中，破坏质膜。其疏水部分与烃基结合，亲水部分与水结合，因此可使脂质和蛋白质增溶（Solubilization）. 本文档共78页；当前第37页；编辑于星期三\10点25分 几种去污剂 去污剂包括两类： 非离子型（nonionic detergents）如Triton X-100、辛基葡萄糖 离子型（ionic detergents）如脱氧胆酸钠、十六烷基三甲基溴 化铵、十二烷基硫酸纳。 本文档共78页；当前第38页；编辑于星期三\10点25分 去污剂的作用机制： ?低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚集在一起，形成微团（micelles）. ?微团亲水部分向外，疏水部分向内。去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数；称临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC）。 本文档共78页；当前第39页；编辑于星期三\10点25分 ?离子型去污剂:除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键, 使蛋白质变性。 ?非离子型去污剂:比离子型温和，不同浓度有不同作用方式 ?高浓度（CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团. ?低浓度（CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部分膜蛋 白的疏水区结合，起增溶作用. 本文档共78页；当前第40页；编辑于星期三\10点25分 ?大部分膜周边蛋白（peripheral protein）是可溶性。它们借离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，故可用高浓度盐或能与二价阳离子（如 Ca2+）结合的试剂进行分离。 ?开发既保持膜蛋白的天然结构，又高产和高纯度纯化方法是人们的期待。（NovaGen新开发TM-PEK:　ProteoExtract膜蛋白抽提试剂盒） 本文档共78页；当前第41页；编辑于星期三\10点25分 第二节 蛋白质的鉴定 一、分子量测定 二、等电点测定 三、末端氨基酸残基测定 四、蛋白质分子中的糖链 五、蛋白质分子中的脂 　 本文档共78页；当前第42页；编辑于星期三\10点25分 一、分子量测定 １.渗透压（osmotic pressure） ２.沉降平衡（sedimentation equilibrium） ３.凝胶过滤层析（gel fitration chromatography） ４.SDS５.激光解吸电离飞行时间质谱（LDI-TOF-MS） 本文档共78页；当前第43页；编辑于星期三\10点25分 1.渗透压（osmotic pressure） ?同时测定几个不同浓度的渗透压，以π/c对c作图并外推到蛋白质浓度为零,得截距,从而求出M。 ?为避免pH值的影响,在溶解度允许的范围内,尽量采用等电点或接近等电点的缓冲液，并增加溶液中无机盐的浓度。 ?可以测分子量在1－10万范围的蛋白质。 ?实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。 本文档共78页；当前第44页；编辑于星期三\1