DB51T 2457-2018斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程.docxVIP

1 ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2457—2018 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发 布 I DB51/T 2457—2018 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 试剂和材料 1 5 主要设备和器械 2 6 临床检查 2 7 样品采集 2 8 细菌分离与纯化 2 9 细菌鉴定 2 10 结果判定 4 11 综合判定 5 附录 A（规范性附录） 试剂配方 6 附录 B（资料性附录） 柱状黄杆菌 16S rRNA 基因参考性序列（1477bp） 8 II DB51/T 2457—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：黄小丽、耿毅、陈德芳、欧阳萍、段靖、冯杨。 1 DB51/T 2457—2018 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了由柱状黄杆菌（Flavobacteriumcolumnare）引起的斑点叉尾鮰（IetalurusPunetaus） 柱形病的临床症状、病原鉴定方法与结果判定。 本标准适用于由柱状黄杆菌感染导致的斑点叉尾鮰柱形病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验方法 GB/T 28630.4 白斑综合征（WSD）诊断规程 第4部分：组织病理学诊断法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.2 鱼类细菌病检疫技术规程 第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法 SC/T 7213 鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 斑点叉尾鮰柱形病 指由柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）感染引起斑点叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）发病 或死亡的一种细菌性疾病。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液与培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T 4789.28、 GB/T 18652、SC/T 7014规定执行， Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+ ）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司 提供的商品化试剂；微生物生化鉴定管可代替相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 2 DB51/T 2457—2018 4.3 引物 16SrRNA基因DNA序列扩增引物，P-F ：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ， P-R ：5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’，保存引物的使用浓度为20 μmol/L， -20℃保存。 5 主要设备和器械 超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光 学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、 铂耳丝、酒精灯等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼体色发黑，反应迟钝，靠边、游动迟缓，摄食减少或停止摄食。 6.2 体表检查 病鱼可出现不同程度烂尾、烂鳍、烂鳃、皮肤灶性腐烂或体表溃疡灶， 部分可在唇部、头部等身体 多个部位出现黄色增生物。 6.3 剖检 病鱼内脏器官病变表现常不明显，偶见脾脏肿大发黑。 7 样品采集 样品采集按SC/T 7103 执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从病鱼溃疡灶边缘、烂鳍烂尾处直接分离接种，常规划线接种至Shieh培养基。 或将病变鳍条或鳃丝剪下， 直接放置在Shieh培养基上接种。28℃培养24h-48h， 从中挑取黄色、边缘不 整齐、假根状、中央较厚的单个菌落在Shieh培养基上进行纯化培养。Shieh平板的配