DB51T 2458-2018大鲵蛙病毒病诊断技术规程.docxVIP

1 ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2458—2018 大鲵蛙病毒病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发 布 I DB51/T 2458—2018 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 试剂和材料 1 5 设备和器械 2 6 临床检查 2 7 实验室样品采集 2 8 病毒分离 2 9 病毒鉴定 3 10 综合判定 4 附录 A（规范性附录） 试 剂 配 方 5 附录 B（资料性附录） 大鲵蛙病毒 MCP 基因参考序列（531bp） 6 II DB51/T 2458—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、刘丹、余泽辉、陈德芳、黄小丽、欧阳萍、邓梦玲。 1 DB51/T 2458—2018 大鲵蛙病毒病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了大鲵蛙病毒病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病毒分 离、病毒鉴定和综合判定等技术规程。 本标准适用于大鲵蛙病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 大鲵蛙病毒病 指由大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus， CGSRV)感染引起的大鲵发病或死亡的一 种病毒性疾病。 3.2 CPE Cytopathic effect 细胞病变效应。 3.3 EPC Epitheliomapapulosum cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞。 3.4 MCP Major capsid protein 基因 主要外膜蛋白基因。 4 试剂和材料 2 DB51/T 2458—2018 4.1 水 用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。 4.2 试剂与培养基 按 GB/T 4789.28 与 SC/T 7014 规定执行。鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）、小牛血清（FBS）、M199营 养液、青霉素、链霉素、Mix-reaction buffer、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试 剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。 4.3 引物 MCP基因序列PCR扩增引物： P1-F： 5’-GACTTGGCCACTTAGA-3’，P1-R： 5’-GTCTCTGGAGAA GAGAA-3’。 - 20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、电子天平、高压灭菌锅、超净工作台、普通冰箱、超 低温冰箱、 一次性滤器（0.22μm） 、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、水平电 泳系统、凝胶成像系统与CO2培养箱等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鲵食欲减退， 摄食减少， 甚至停止摄食， 部分病鲵出现呕吐， 偶尔呕吐物混有血液； 体表粘液分 泌增多，活动缓慢，反应迟钝，常静卧池底。 6.2 外部检查 病鲵全身性肿胀、出血， 尤其头部与四肢明显， 体表皮肤与肌肉溃烂， 形成溃疡， 严重时肿胀的四 肢溃烂。 6.3 剖检 口腔黏膜偶见出血与溃疡； 腹腔常见淡黄色澄清或含血液体； 肝肿大， 淤血、出血， 呈花斑状； 脾 肿大， 严重瘀血呈紫黑色或散在灰白色坏死灶； 肾肿大， 斑点状出血； 肺囊充血、出血； 胃肠道呈出血 性－卡他性炎。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 与 GB/T18088 执行。体长≤5cm的大鲵苗取整条，体长5-10cm的大鲵苗取 内脏（包括肾），体长≥10cm的大鲵则取肝、脾、肾。 8 病毒分离 8.1 样品处理 3 DB51/T 2458—2018 应在10℃以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆， 再用细胞培养液PBS缓冲