索拉非尼联合柔霉素对白血病细胞k562及u837抑制作用及相关分子机制研究.docxVIP

索拉非尼联合柔霉素对白血病细胞k562及u837抑制作用及相关分子机制研究 牙龈疾病是由缺血干或祖细胞突变引起的系统血肿，约占肿瘤发病率的5%。这是儿童和青少年中最常见的肿瘤。目前白血病的传统治疗方法仍然是以蒽环类抗生素如:柔红霉素(daunorubicin, DNR)为主的联合化疗方案。但因为白血病细胞遗传学的不同,不同白血病细胞对化疗的敏感性不同,存在原发性耐药和继发性耐药。目前已有人已经证明活化的Raf/MEK/ERK通路能够通过磷酸化激活核转录因子,上调P-gp的表达,诱导耐药,因此寻找一种合理有效的治疗白血病的方案有重要意义。索拉非尼(sorafenib)是一种口服的Raf激酶(丝裂原活化蛋白激酶信号转导的关键调节者)抑制剂,已经被FDA批准用于肝癌和肾癌的治疗,能够通过抑制Raf/MEK/ERK(丝裂原活化蛋白激酶通路,mitogen-activated protein kinase/ERK kinase/ERK extracellular-signal-regulated kinase pathway)通路抑制肿瘤细胞增殖和血管形成,发挥抗肿瘤的作用。本研究探讨索拉非尼联合柔红霉素作用于人白血病K562和U937细胞株的抑制作用,证实2药联合具有协同作用,并阐述产生协同作用可能的分子学机制。 材料和方法 1 样品和检测试剂 索拉非尼购于拜耳公司,MEK抑制剂U0126购自Alexis,柔红霉素和噻唑蓝[MTT,3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]购自Sigma。Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst 33258均购于南京凯基生物发展有限公司。兔抗p-ERK1/2、ERK1/2单克隆抗体均购自Cell Signal Technology。人髓系白血病细胞株K562、U937由中山大学附属肿瘤医院刘强教授馈赠。 2 方法 2.1 对象养基的制备 K562和U937细胞在37 ℃、5% CO2孵箱中培养,培养基为含10%的灭活新生牛血清的RPMI-1640培养基,加入1×105U/L的青霉素和100 mg/L的链霉素。细胞呈悬浮状态生长,约1-3 d传代1次,取对数生长期细胞用于实验。 2.2 细胞培养和联合抑制率测定索拉非尼对k562和u37的表达 取对数生长期K562和U937细胞,以5×103cells/well的密度接种于无菌96孔板,摇匀后加入药物。以柔红霉素单药作用于K562(0、1.0、2.5、5.0、10、20、40 mg/L)和U937(0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0.8.0 mg/L)细胞,作用24 h后加入MTT,再孵育4 h,加入100 μL DMSO溶解结晶,酶标仪测定490 nm吸光度值,通过公式计算得到DNR对K562和U937的IC50和IC10,以同样方法测定索拉非尼对2种细胞的IC50。当研究2药联合作用时,以DNR对K562和U937的IC10联合不同浓度的索拉非尼(4、8、12、16 mg/L),同时作用于白血病细胞,测定48 h后的联合抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%。以上实验均至少重复3次。 2.3 药物联合抑制率测定 将对数生长期K562细胞以1×106cells/well的密度接种于6孔板,随后加入实验药物处理,给药方式和处理时间与测定2种药物联合抑制率的浓度和方式一致。处理48 h后,收集细胞于流式细胞仪检测管,离心后以冷PBS洗涤2次,离心10 min后以500 μL buffer将细胞混匀,加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL和PI 5 μL,避光反应15 min后,流式细胞仪检测各个不同处理组的凋亡率,不同浓度组均重复3次试验。 2.4 k562细胞凋亡检测 采用Hoechst 33258 DNA染色 收集柔红霉素、索拉非尼单药及联合处理48 h的K562细胞,离心沉淀,以蒸馏水洗2次后加入甲醛溶液(4%)固定10 min,将细胞悬液滴于载玻片上,待载玻片干燥后,以Hoechst 33258工作液染色5-10 min,在有紫外光的荧光显微镜下观察,并随机拍照,计数凋亡细胞的数量。 2.5 pca法检测各管蛋白浓度 U937、K562细胞未处理及单药及联合处理后,收集细胞,以预冷PBS洗涤2次后,加入含PMSF的裂解液,在冰上裂解15-20 min,15 000 r/min离心10 min后,将上层液体转移至新EP管。以BCA法测定各管蛋白浓度,并调节各管最终浓度为4.0 g/L。分装样品后,加入5×SDS上样缓冲液