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不同抗性甜瓜属作物根系中的葫芦素b cucurbatin是一个甲基环化合物，通常存在于cuurbatin植物中。葫芦素共有14种,分别为葫芦素A、B、C、…N,多以配糖体或葡萄糖甙的形式存在于植物体内。多数葫芦素含有苦味,对人及大多数动物均有毒害作用,被认为是防止或阻止动物对其伤害的化学生态物质。黄瓜中的葫芦素主要为B和C,其子叶中含有B和C,叶片及植株中含有C,而根系中只含有B。Tallamy发现,葫芦科植物遭瓜植食性瓢虫(Epilachna borealis)为害后,叶片中葫芦素B含量升高,从而使其对该瓢虫的适生性降低。张茂新等研究认为,葫芦素B是影响美洲斑潜蝇(Liriomyza sativaeBlanchard)寄主选择性的重要因素之一。刘慧等研究发现,黄足黄守瓜(Aulcophora femoralis chinensis)为害南瓜(Cucurbita moschata)后,其子叶中葫芦素B含量升高。上述研究说明,植物体内葫芦素B的含量高低与植物受害程度之间存在密切联系。 酸黄瓜(Cucumis hystrixChakr.,2n=24)为原产中国云南的甜瓜属珍稀野生物种,抗病鉴定结果表明,酸黄瓜对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有高度抗性。酸黄瓜的南方根结线虫病抗性有其内在的影响机制。生理学机制研究表明,线虫侵染后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等保护酶类活性发生改变,通过直接或间接编码木质素的生物合成而使细胞壁加厚,从而表现出抗病性;解剖学及其细胞学研究表明,酸黄瓜南方根结线虫病抗性的主要特征表现为抗侵入、抑制取食和坏死反应。根结线虫对寄主植物的选择性以及酸黄瓜对根结线虫的抗性程度与植物中葫芦素B含量的关系值得深入研究,这对深入了解线虫和植物的关系,探索线虫与寄主植物间的化学机制具有重要意义,同时为抗线虫材料选育、线虫控制新方法的研究提供依据。 1 材料和方法 1.1 抗南方根结线虫材料 甜瓜属野生种酸黄瓜与非洲角(C.metuliferusNaud.,2n=24)高抗南方根结线虫,普通栽培黄瓜北京截头(C.sativusL.,2n=14)对南方根结线虫表现高感,上述材料均为南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室黄瓜研究室提供。 1.2 盆钵中植物接种 供试植物材料采用直播,将各参试材料播种在装有经高温灭菌(120℃,1 h)的基质(泥炭土∶蛭石=1∶1)、规格为15 cm×10 cm的盆钵中,待幼苗长到3～4片真叶时开始接种。接种采用卵液接种法,卵悬浮液的制备参照Hussey等的方法,接种参照陈劲枫等的方法,接种量为2 000个卵/株,每份材料各接种15株,3次重复,完全随机设计,接种后进行正常的肥水管理。 1.3 葫芦素b标准品 高效液相色谱仪(HPLC)使用日本岛津LC-10ATVP型,色谱柱为C18反相柱(Hypersil 5 μm,4.60 mm×250 mm)。葫芦素B(cucurbitacin B,简称CuB)标准品购于上海海灿生物技术有限责任公司,纯度98.83%。植物葫芦素B的提取、高效液相色谱流动相分别使用一级色谱纯甲醇与分析纯甲醇,均为上海星可生化有限公司提供,水为重蒸馏水。 1.4 保留时间和峰面积的测定 准确称取葫芦素B标准品1 mg,用10 mL的色谱纯甲醇溶解成100 mg/L,再用逐步稀释法分别配制10、8.75、7.5、6.25、5、3.75、2.5、1.25、0.625 mg/L葫芦素B甲醇溶液,在高效液相色谱仪上测定相应色谱峰的保留时间和峰面积。以葫芦素B浓度(x)为横坐标,以色谱峰面积(y)为纵坐标,制作葫芦素B的标准曲线,并计算y与x之间的回归方程,然后用此回归方程计算供试植物材料中的葫芦素B含量。 葫芦素B采用冷浸法提取,含量测定参照Horie等的方法并略有改动。于接种后30、40、50 d对供试材料根系进行取样,同时取相应生长期的未接种材料作对照,样品经蒸馏水冲洗、剪碎后加液氮研磨,充分混匀后准确称取1 g粉末样品放入20 mL的广口瓶中,加10 mL甲醇浸泡24 h,然后用0.26 μm有机相微孔滤膜过滤,备测。样品HPLC测定条件:流动相为甲醇-水(70∶30),柱温30℃,流速1.0 mL/min,检测波长228 nm,进样量10 μL。 1.5 根结及卵块指数g 接种8周后调查统计每株根系的根结数和卵块数。根结数和卵块数的分级参照Hartman等的方法,共分为6级:0级表示没有根结或卵块,1级为1～2个根结或卵块,2级为3～10个,3级为11～30个,4级为31～100个,大于100个为5级;根结指数和卵块指数的计算公式为: G(E)I=∑(ri·ni)/N 式中GI为根结指数;EI为