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鸡传染性支气管炎病毒jq4801的分离鉴定 1998年秋天，天津郊区的一些鸡场出现了新城病、呼吸传播和肾传播苗（1.2）。我们从病料中分离到一株能使鸡胚发育迟滞, 胚体卷曲的冠状病毒JQ9801株。现报告如下。 1 材料和方法 1.1 病理检查 按常规方法对送检鸡、攻毒鸡进行病理解剖学检查。 1.2 病毒分辨率 (1) 离心液的制备 无菌采取病、死鸡腺胃、肝脏、胰腺、脾脏加灭菌石英砂研磨成匀浆, 用生理盐水制成1∶5混悬液, 加青霉素和链霉素, 使其最终浓度分别为3 000 U/mL和3 mg/mL, 冻融3次, 台式离心机3 000 r/min离心20 min, 取上清液备用。 (2) 龄fps胚的制备 取上述处理好的样品经无菌检查合格后加温至37 ℃, 以0.2 mL/胚的量尿囊腔接种 (9～11) 日龄SPF鸡胚;另设一组同日龄SPF胚为对照, 接种等量生理盐水 (初代盲传) 或未经任何接种的SPF胚尿囊液 (其他代次) 。弃去接种后24 h内死亡的鸡胚, 收集此后死亡及成活的鸡胚尿囊液, 同量盲传下一代SPF鸡胚。在低代次盲传中, 于接种后 (72～120) h收获, 第4代起, 于接种后48 h收获;并留部分接种胚继续孵育 (7～8) d, 收获称重, 与同龄对照胚比较。收获各代次尿囊液均作细菌学检验。 1.3 红细胞凝集试验 以1 %鸡红细胞悬液在V型底96孔板上对病料1∶5生理盐水悬液、每代次接种胚和对照胚的尿囊液进行血凝性检测。 1.4 病毒的集中和简化 (1) 6-f型 h收获尿囊液400 mL以5 000×g离心30 min, 取上清液; (2) 清液g，g，离心分离1 h, 取沉淀物; (3) 沉淀条带的制备 0.01 mol/L, pH7.2 PBS悬浮, 振荡均匀, 加至依次由30 %、40 %、50 %、60 %蔗糖制成的密度梯度上, 以91 000×g离心2 h, 取沉淀条带; (4) 收集沉淀带，加入10倍量的pbs，悬挂并均匀旋转，再次以91000g离心1.5 h, 取沉淀用2 mLPBS悬浮、振匀。 1.5 电镜观察 取浓缩前后每一步骤尿囊液及其产物进行磷钨酸负染, 电子显微镜检查。 1.6 动物接种 取JQ9801株第4代尿囊液攻毒10日龄传支未免疫鸡, 眼、鼻、口各接种50 μL;对照组接种等量生理盐水, 隔离饲养。 1.7 鸡胚已基本情况 及传支高免血清鸡胚半数保护量 (EPD50)的测定 取第6代JQ9801株尿囊液按常规方法、进行, 观察9 d。在接种24 h后死亡、病变、存活的鸡胚计入试验数据, 按Reed-Muench法算出EID50和EPD50。测EPD50时, JQ9801株的最终浓度为1, 000 EID50/0.1 mL, 每型血清最终稀释度均为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160。T、H120型高免血清由中国农大实验动物研究所制备, QX型高免血清系青岛动物检疫所用腺胃型传支病毒QX株制备, 由青岛动物检疫所王玉东高级兽医师惠赠。 1.8 油乳剂疫苗 以JQ9801尿囊液0.1 mL/枚接种10 d非免疫鸡胚, 37 ℃孵育, 收获尿囊液, 按文献法制成灭活油乳剂疫苗。给11 400只7 d龄雏鸡作新城疫、呼吸型传支和肾型传支免疫, 再随机取其中750只皮下注射0.3 mL/只JQ9801灭活苗, 混群饲养。 2 结果 2.1 胰腺组织病理学 病鸡极度消瘦, 胸如刀刃;剖检可见腺胃肿大如球, 腺胃乳头肿胀、凹凸不齐、出血、坏死, 粘膜有出血点;胃壁地厚约5 mm以上, 切面外翻;肌胃滞疡、出血;胰腺充血、出血;盲肠扁桃体出血、坏死。 2.2 病毒分辨率 (1) 疾病信息 腺胃等1∶5混悬液细菌学检查为阴性。 (2) 试验胚的形态特征 盲传到第7代。第2代个别试验鸡胚胚体较小;第4代开始, 全部试验胚稳定出现侏儒胚。侏儒胚羊膜增厚, 常紧密粘裹在胚体表面不易剥离, 胚体卷曲, 胚爪粘搭在头顶不易分开 (见图1) 。接种JQ9801株后8 d收获的第5代试验胚平均体重为13.58 g, 同龄对照胚平均体重为23.96 g,P0.01, 差异极显著。此外试验胚常有皮肤充血、出血、胚体水肿等病变。盲传低代次试验胚死亡不多, 至第6代, 10-5×稀释JQ9801株接种胚死亡率为6/7。 各胚细菌学检查均为阴性。 2.3 红细胞凝集试验 病鸡病料1∶5生理盐水悬液、各代次试验胚、对照胚尿囊液的红细胞凝集试验均为阴性。 2.4 典型粒子和纤突从线检测,主要有两种 51 000×g离心后的JQ9801株尿囊液沉淀物经蔗糖梯度超离, 在40 %蔗糖层中间及40 %与50 %蔗糖界面各出现一条乳白色沉淀条带, 尤以后一条致密且稍宽。电镜检查第5代尿囊液 (未浓缩) ,