2荧光光度法测定维生素B2含量.docVIP

实验五荧光光度法测定维生素B2的含量 一、实验目的 1、学习荧光分光光度法测定维生素B2的剖析原理； 2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素B2的方法。 二、实验原理 荧光光度法原理 （1）常温下，处于基态的分子汲取必定的紫外可见光的辐射能成为激发态分 子，激发态分子经过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的 形式回到基态，发出比汲取光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度 IF与物质的浓度c有以下的关系： IF2.303I0bc 当实验条件一准时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： IFKc 这是荧光光谱法定量剖析的理论依照。 （2）荧光剖析法的特色： 与紫外-可见分光度法比较，荧光剖析法拥有更高的敏捷度。 选择性好。荧光法既能依照发射光谱，又能依照汲取光谱来判定物质。 所需试样量少、操作方法简易。 （3）荧光光谱 激发光谱：固定丈量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照耀光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。 发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。 固定发射光波进步行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，而后固定激发光波进步行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的重点。 （4）荧光剖析仪器 常用的荧光剖析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构 成，以下列图所示： I0I 单色器液槽 光源If 单色器 I0 显示器检测器 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量 维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其构造式为： OH HO H HO H HO H H H H3C N O N NH H3C N C O 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳固，光 照易分解，对热稳固。维生素B2溶液在430～440nm蓝光的照耀下，发出绿色 荧光，荧光峰在535nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11 的碱性溶液中荧光消逝，所以能够用荧光光度法测维生素B2的含量。 多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，此中维生素C和葡萄糖 在水溶液中不发荧光，维生素B1自己无荧光，在碱性溶液顶用铁氰化钾氧化后 才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸办理后才有荧光，他们都不扰乱维生素B2的 测定。 维生素B2在碱性溶液中经光芒照耀会发生疏解而转变为光黄素，光黄素的 荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内， 且在避光条件下进行。 三、试剂与仪器 仪器：970CRT荧光光度计，5ml吸量管1只，2ml吸量管1只，50ml容量瓶 6只,100ml容量瓶1只， 试剂：10.0μg/ml（实质浓度请自己记录）维生素B2标准溶液，冰乙酸，试样若干 四、实验步骤 970CRT荧光光度计的基本操作 先翻开氙灯，再翻开主机，而后翻开计算机电源，荧光光度计工作站自动启动并初始化仪器，预热20—30min 仪器初始化完成后，在工作界面上选择丈量项目，设置适合的仪器参数比如：设置激发波长为440nm，发射波长为330nm，敏捷度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。 样品测定 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 在6个洁净的50ml容量瓶中，分别汲取 0.50、1.00、1.50，2.00，2.50 和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。获得不一样浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓丈量系列标准溶液的荧光强度。 未知试样的测定: 正确称取一片维生素B2片,用研钵研细，加少许水溶解后（不得超出定容 体积），将其所有转入50ml比色管中，于超声振荡器中超声溶解后，定容。 将超声分解后的样品试液经0.45μm膜过滤后,正确取滤液适当置于50ml比 色管中，加2.00ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时同样的条件， 平行丈量其荧光强度3次。 （黑体字部分实验报告中请按自己实质操作撰写） 定性实验：改变狭缝宽度、敏捷度、扫描速度，记录发射光谱曲线，进行实验条件的议论。 退出主程序，封闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 五、实验结果及数据办理 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 2．依据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。 六、思虑题 1.试解说荧光光度法较汲取光度法敏捷度高的原由? 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为什么在酸性溶液中测定？ 怎样绘制激发光谱和荧光发射光谱? 五．实验结果及数据办理 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线表一 C/μ