EMSA 操作手册2 - 系统集成.docxVIP

er中漂洗膜1-5min。在适量Blockingsolutiionbuffer中平衡 er中漂洗膜1-5min。在适量Blockingsoluti ionbuffer中平衡2-5min。20．将膜转有DNA的 膜上，避免气泡产生，使CSPD能均匀分布于膜表面，15-25 workingsolution:将0.1mg/ml的储液用D 寡核苷酸标记： 1． 将序列互补的寡核苷酸片断在 TEN-buffer（ 10mM Tris, 1mM EDTA, 0.1M Nacl, pH8.0 ） 中按摩尔比 1：1 混合。 2． 95℃ 10min 使核苷酸片断充分解离。 3． 将样品缓慢冷却至 15-25℃。 4． 用灭过菌的 TEN-buffer 将核酸稀释至 3-4pmol/ul 5． 取 3.85pmol 或 100ng 稀释好的核苷酸加入小炮弹管中，并加入 ddH2O 使终体积达到 10ul。（对照管中加入 1ul 对照寡核苷酸（管 6）和 9ul 的 ddH2O ）。 6． 将以上小管放在冰上并依次加入以下试剂： 4ul 5 ×Labeling buffer （管 1） 4ul CoCl2-solution （管 2） 1ul DIG-ddUTP solution （管 3） 1ul 末端转移酶（ 400U ）（管 4） 7． 小心的将以上溶液混匀并迅速进行离心。 8． 在 37℃反应 15min ，之后置于冰上。 9． 加入 2ul 0.2 M EDTA (pH8.0) 终止反应。 10． 再加入 3ul ddH2O ，使终体积达到 25ul ，标记好的寡核苷酸浓度达到 4ng/ul 或 0.155pmol/ul。 标记效率测定： 11． 试剂准备：见样品检测部分的试剂准备。 12． 按下表制备系列稀释的制备标记寡核苷酸和对照组标记寡核苷酸。 管号 管号 1 2 3 4 5 寡 核 苷 酸 （ul） 2 2 2 - 稀 释 母 液 管 最初管 1 2 3 - TEN-buffer 0 18 18 18 20 稀释倍数 - 1：10 1：100 1：1000 - 终 浓 度 （fmol/ul ） 155 15.5 1.55 0.155 0 终 浓 度 （ng/ul ） 4 0.4 0.04 0.004 0 13． 各取对照组和制备组 1-5号管中标记的寡核苷酸 1ul 点在尼龙膜上 14． 紫外灯下交联 5min 或 120℃烤 30min 使标记的寡核苷酸固定在膜上。 15． 15-25℃在 Washing buffer 中漂洗膜 2min。 16． 在 10ml Blocking solution 中孵育 30min。 17． 在 20ml Anitybody solution 中孵育 30min。 18． 用 10ml Washing buffer 漂洗两次， 每次 15min。 19． 在 10ml Detection buffer 中平衡 2-5min。 20． 将膜转有 DNA 的一面向上平放于塑料膜上，在上面均匀加上 0.1ml CSPD working solution。 21． 立即将塑料膜折起，盖在尼龙膜上， 避免气泡产生，使 CSPD 能均匀分布于膜表 n。通过与对照组DIG-标记的DNA（管7）曝光情况对比就可膜上。15．15-25℃在 n。通过与对照组DIG-标记的DNA（管7）曝光情况对比就可 膜上。15．15-25℃在Washingbuffer中漂洗膜 苷酸链用水稀释到15.5fmol/ul.27．样品准备：28 ionbuffer中平衡2-5min。20．将膜转有DNA的 22． 23． 29． 30． 挤出多余的液体，将塑料膜沿尼龙膜边封好，在 37℃再孵育 10min。 15-25℃ 用 X 胶片曝光 15-25min。 通过与对照组 DIG-标记的 DNA （管 7） 曝光情况对比就可以确定标记的效率。 样品检测 ： 24． 配制浓度为 6－8％含 0.5 ×TBE 的非变性聚丙烯酰胺凝胶。 （配方： 3.6ml H2O; 1.2ml 丙稀酰胺； 600ul 甘油； 600ul TBE ； AP 42ul ； TEMED 2.1ul ） 25． 将用 DIG 标记的寡核苷酸链用水稀释到 15－30fmol/ul. 26． 将标记的对照组寡核苷酸链用水稀释到 15.5fmol/ul. 27． 样品准备： 编号 编号 1 2 3 样品（实验组/对照组） 标记的寡核苷酸 标记的寡核苷酸和相应蛋白 标记的寡核苷酸和相应蛋白及用于特异竞争 的未标记寡核苷酸。（ 125 倍于标记