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地衣芽孢杆菌hdym 它也被称为i-1。4-d-甘露醇酪氨酸酶（i-1，4-d-mannase，ec.3.2.1.78）-d-甘露醇酪氨酸酶或-d-甘露醇酪氨酸酶，是一种含有甘露醇4-d的内切酶。这些物质包括甘草糖和甘露醇（包括甘草糖、半乳液甘露醇、葡萄糖甘露醇等）。属于半纤维素酶类。β-甘露聚糖酶广泛分布在自然界中,其中微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、生产成本低、来源稳定、提取方便等明显优点,已在实际生产(造纸、食品、农业、石油开采)和基础研究(用作工具酶)等诸多领域得到广泛应用。尤其是β-甘露聚糖酶水解β-甘露聚糖型植物胶,如:角豆胶、瓜儿豆胶、槐豆胶和魔芋等可生成低聚甘露糖,低聚甘露糖作为食品添加剂的应用已引起了国内外食品和医药界的极大兴趣。 近年来,通过微生物发酵提高β-露聚糖酶活力的研究主要集中在酶高产菌株的筛选及产酶基因的克隆、基因工程菌的构建及β-甘露聚糖酶的异源表达等方面。而在发酵罐水平上优化工业发酵条件研究虽不少,补料发酵研究却未见报道。因此,本实验利用微生物黑龙江省高校重点实验室分离的一株β-甘露聚糖酶高产菌株地衣芽孢杆菌HDYM-04在5L发酵罐中发酵生产β-甘露聚糖酶,对发酵及补料条件进行优化。旨在为其应用于工业生产提供指导。 1 材料和方法 1.1 培养基g/l 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformics)HDYM-04由黑龙江大学微生物重点实验室保藏。 LB培养基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物5、Na Cl10,p H7.0,121℃灭菌15min;种子培养基(g/L):魔芋粉10、蛋白胨30、K2HPO45、Mg SO4·7H2O 0.2,p H8.0,121℃灭菌15m in;发酵培养基(g/L):魔芋粉20、蛋白胨30、K2HPO45、Mg SO4·7H2O 0.2,p H8.0,121℃灭菌20min。 5L自控机械搅拌发酵罐上海保兴生物设备工程有限公司。 1.2 培训方法 1.2.1 材料1.2 从斜面挑取适量菌种接入LB培养基中,3 7℃、160r/min培养12h。之后再以1%接种量转接入种子培养基中,37℃、160r/min培养12h即为种子液。 1.2.2 菌株2,10min 5L自控机械搅拌发酵罐中装3L发酵培养基,121℃离位灭菌20min。加入魔芋粉,之后在火焰保护下将种子液接入发酵罐中,发酵温度(37±0.2)℃、搅拌速率300r/min、通气量3L/mi n,发酵48h,初始p H8.0。 1.3 指标测定 1.3.1 菌体密度的测定 取适量混匀的发酵液,以质量分数0.9%Na Cl溶液进行适当稀释后,以0.9%Na Cl溶液作为空白参照,在波长600nm处测定菌悬液的光密度(OD600nm),以光密度值与稀释倍数乘积作为菌体密度。 1.3.2 糖、氢、钠-柠檬酸等为底物的抗氧化酶系统 参照Akino等方法稍加修改,用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定酶活力。以0.5g/100m L去除还原糖的魔芋粉为底物(p H4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制),在0.9m L底物中加入0.1m L粗酶液,置55℃水浴反应30min,加入DNS试剂3m L,沸水浴显色5min,冷却后定容至25m L,以不加酶的底物作为空白对照,在波长550nm处测定吸光度。酶活力单位(U)定义为:在上述反应条件下,每分钟产生相当于1μmolβ-甘露糖的酶量。 1.3.3 糖含量的测定 DNS法测定还原糖含量。 2 结果与分析 2.1 魔芋粉加入量的确定 设定起始魔芋粉加入量分别为10、20、30g/L,接种量3.3%,培养温度37℃、搅拌转速300r/min、通气量3L/min,按1.2.2节方法进行分批发酵,以酶活力为指标考察HDYM-04产酶的最佳初始魔芋粉加入量,结果如图1所示。 由图1可见,随着初始魔芋粉加入量的变化,菌体的生长及产酶状况表现出了明显的不同。魔芋粉的主要成分为甘露聚糖,加入培养基中会导致发酵液黏稠、搅拌阻力增大、热传导效率降低,同时还会导致溶氧量的急剧降低从而极大地影响菌体的生长。高质量浓度魔芋粉加入量会导致菌体生长延滞期的延长(图1C)。魔芋粉加入量为10g/L时,种子液接入后持续生长入对数生长期;而当魔芋粉加入量增至30g/L时,经12h才进入对数生长期。综合图1可以看出,该菌株所产β-甘露聚糖酶是一种胞外诱导酶,伴菌体生长分泌,属于生长偶联型产物。发酵过程的p H值总体呈先降低后上升的趋势,这与菌体在发酵初始阶段大量繁殖,经TCA循环有机酸大量积累有关,这一点从初始阶段还原糖量大大增加(即魔芋粉大量分解)也可以说明。进入稳定期后,发酵液p H值开始上升,可能是由于溶氧的急剧降低使菌体的代谢途径发生改变,从而造成其他蛋白酶的分泌,导致