不同标准品对高效凝胶渗透色谱法测定低分子海洋硫酸多糖药物ccs的相对分子质量的影响.docxVIP

不同标准品对高效凝胶渗透色谱法测定低分子海洋硫酸多糖药物ccs的相对分子质量的影响 糖是自然界中常见的生物颗粒。这是一种分散的聚合物。据大量研究，糖具有多种药理活性，如肿瘤、抗炎、抗凝剂和抗炎等。多糖的药理活性与其相对分子质量(MW)及其分布密切相关,中华人民共和国药典已将MW及其分布列入多糖药物的质量标准。以海洋甲壳质为原料,经分子修饰而制得的低分子海洋硫酸多糖药物CCS,经药理学研究表明其具有明显的降血脂和促进内皮细胞生长的作用。由于高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)具有快速、重现性好等优点,被广泛应用于多糖MW及MW分布的测定。为了考察相对分子质量不同的标准品对测定结果的影响,本研究分别采用葡聚糖和低分子肝素作标准品,测定了CCS的MW及其分布,并对测定结果进行了比较。 材料和方法 1 ran、采用、mw、3.1.3研究对象 高效液相色谱仪:美国Waters公司515型液相色谱仪,2410示差折光检测器,GPC软件。 系列标准葡聚糖(Dextran,Phenomenex产品),MW分别为1 200,3 650,5 700,11 700,25 500;系列标准肝素(由美国爱荷华大学Dr. Linhardt实验室提供),MW分别为665,1 330,1 995,2 660,7 500;无水硫酸钠为分析纯试剂。CCS(本所提供,批号20000521。 2 色谱柱及流动相 色谱柱:日本TOSOH公司TSKgel G3000 PWXL凝胶色谱柱(300mm×7.8mm),流动相:0.7%Na2SO4水溶液;流速:0.5mL·min-1;柱温:35℃;进样量:20μL。 3 测量 3.1 标准曲线的绘制 分别以标准葡聚糖和肝素为标准品,各取5个不同MW的标准品,加流动相溶解制成5mg·mL-1的标准溶液,分别取20μL注入液相色谱仪,记录色谱图及保留时间tR,应用GPC软件绘制标准曲线。其回归方程分别为:葡聚糖:lgMW=8.831-0.318tR,r=0.997;肝素:lgMW=8.437-0.354tR,r=0.998。 3.2 滤膜和滤液 精密称取CCS适量,加流动相溶解,制成5mg·mL-1的溶液,用0.45μm滤膜过滤,滤液4℃保存备用。取20μL CCS样品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图,根据标准曲线由GPC专用软件计算样品的重均相对分子质量MW、数均相对分子质量Mn及分布宽度D。 结果 1 mw的累积重量分布曲线 样品的HPGPC 谱图共有3个峰,前面的峰为CCS,后面的两个尖峰为其中的小分子杂质,计算MW时不计,见图1。 MW累积重量分布曲线如图2所示。 从图2可得到样品中各级分MW和相对含量,以不同标准品测定时其MW分布宽度亦有明显差别。 2 结果表明，葡萄糖和肝素是标准物质 采用GPC软件处理上述色谱图得到MW,Mn和分布宽度D,分别以葡聚糖和肝素为标准品时的测定结果见表1。 流动相的确定 本研究表明以不同标准品来测定CCS的MW及分布宽度时,结果差异很大。由于CCS为低分子海洋硫酸多糖,其分子本身带有电荷,在结构上与肝素极其类似,而葡聚糖为电中性物质,结构上与CCS相差较大,HPGPC法测定聚合物MW时,色谱柱的淋出体积真正反映的是试样的流体力学体积,因而只能用于测定与标准品相同的试样,不同类型的高分子当MW相同时它们的流体力学体积并不相同,因此当使用不同的标准品时测定结果有较大差异。为了给出真实的MW,应选择与被测样品相同的标准品或结构相似的标准品为好,否则误差较大。为了进一步确证实验结果,改用2.84%的Na2SO4水溶液做流动相,实验结果表明,在以肝素做标准品时,MW测定结果与用0.7%的Na2SO4水溶液做流动相相比没有明显变化。以葡聚糖做标准品时,MW测定结果与用0.7%的Na2SO4水溶液做流动相相比降低25%,但仍与以肝素做标准品时测定结果相差很大,通过改变流动相仍不能消除不同标准品对测定结果的影响。因此在采用HPGPC法测定多糖MW分布时要选择与样品结构性质相同的标准品,在采用不同质标准品时其测定结果只具有相对意义而不能代表样品的真实结果。