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环丙沙星压力下沙门氏菌耐药机制研究 沙门氏菌是公共卫生中具有重要重要性的人类疾病。它是世界上最常见、最常见的食品原因（kim等人，2011），也是引起胃肠炎、细菌血清素等疾病的主要药物。也。喹诺酮类药物作为治疗该菌感染的首选药物 (Asperilla等, 1990) , 在人与兽医临床上得到广泛应用, 但由于不规范用药及不合理饲料添加, 使得该菌在药物选择性压力下, 对抗生素的敏感性不断下降, 产生耐药 (Molbak等, 1999;Vasallo等, 1998) 。不同血清型沙门氏菌因适应环境的能力有差异, 在环境中流行分布也存在差异。中国人医临床分离沙门氏菌以肠炎型和鼠伤寒型为主, 而兽医临床及动物食品中以印第安纳型沙门氏菌较为流行。血清型与耐药性之间相关性研究发现, 分离自患病动物的沙门氏菌多为印第安纳型且对抗生素有多重耐药表型, 分离自健康动物的沙门氏菌多为鼠伤寒和肠炎型, 且对抗生素敏感。这种不同血清型沙门氏菌在流行分布和耐药表型上的差异提示在抗生素压力下不同血清型沙门氏菌突变频率及耐药形成机制存在差异。本研究从养殖场分离筛选到3株不同血清型沙门氏菌的敏感株, 在不同环丙沙星 (CIP) 压力下进行诱导, 来探讨不同血清型菌株在抗生素压力下突变频率的变化情况及耐药性增强过程中靶位基因、外排泵活性和调控基因变化之间的异同, 为进一步阐明非伤寒沙门氏菌耐药机制及耐药性防控提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 沙门氏菌的筛选 3株分离自养殖场的不同血清型 (印第安纳型菌株SP49、肠炎型菌株BJ2、鼠伤寒型菌株SH10) 沙门氏菌, 且对环丙沙星敏感。质控菌ATCC 25922、沙门氏菌参考菌株SL 1344均由华南农业大学药理教研室保存。 1.1.2 培养基和试剂 M-H琼脂 (mueller-hinton agar) 培养基、M-H肉汤 (mueller-hinton broth) 培养基、LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、SS琼脂 (salmonella-shigella agar) 培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司;Ex TaqTMDNA聚合酶、RNAiso Plus试剂盒、Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Erase、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 均购自TaKaRa公司;盐酸环丙沙星标准品购自中国药品生物制品检定所;乙腈 (色谱纯) 购自CNW公司;羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP) 、盐酸甘氨酸、盐酸环丙沙星均购自Sigma公司;二乙胺、磷酸、磷酸二氢钾等其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 最低抑菌浓度 采用琼脂平板二倍稀释法测定3株不同血清型沙门氏菌在诱导前后对环丙沙星、萘啶酸的最低抑菌浓度 (MIC) , 用标准菌ATCC 25922进行质量控制, 重复3次。按照美国临床实验室标准化研究所 (CLSI/NCCLS) 2013年标准判读结果。 1.2.2 培养组合的确定 根据母株对环丙沙星的MIC值, 分别制备含0.25×、0.5×、1×、2×、4×、8×和16×MIC的环丙沙星M-H琼脂平板。从SS平板上挑取相应菌株的单克隆于3 mL LB肉汤培养基中, 37℃、200r/min培养6~8h, 使细菌浓度达到108CFU/mL左右。取1 mL细菌培养物于EP管中, 10000 r/min离心1 min, 弃上清。沉淀用100μL LB肉汤培养基悬浮后涂布于选择性M-H琼脂平板上, 然后置于培养箱中37℃过夜培养。从选择平板上挑取一个单克隆, 在含有与琼脂平板相同药物浓度的3mL LB肉汤培养基中培养, 做下一步诱导培养。诱导菌于甘油肉汤中―20℃保存。重复以上方法, 获得系列对环丙沙星耐药的诱导菌。环丙沙星筛选终浓度为16μg/mL。 1.2.3 细菌培养和给药 从SS琼脂平板上挑取各1/2 MIC浓度下得到的突变株于3mL LB肉汤中, 37℃、200r/min培养6~8h, 使细菌浓度达到108CFU/mL左右, 取1mL菌液10000r/min离心1min后, 涂于对应浓度的环丙沙星琼脂平板上, 同时取等量菌液梯度稀释后涂于未加药的LB琼脂平板上, 过夜培养。第2天计数, 得3次重复的平均值, 计算出突变频率。 1.2.4 外排泵调控基因关联引物的扩增 根据GenBank中登录的基因序列及参考相关发表文献, 采用Primer Premier 5.0软件设计扩增喹诺酮耐药决定区 (QRDRs) 与外排泵调控基因ramR-ramA引物。引物序列见表1。引物送上海英骏生物技术有限公司进行合成。 1.2.5 引物退火温度 对所有不同耐药水平的菌株采用水煮法提模板, PCR扩增Q