二维液相色谱-质谱联用分离复方葛根芩连汤.docxVIP

二维液相色谱-质谱联用分离复方葛根芩连汤 多层液体层析成像分离技术（mdlc）用于将不同大小的丝状波束从复杂样品中分离分析组件。不同的液相色谱模式如排阻色谱 (SEC) 、亲和色谱 (AC) 、离子交换色谱 (IEC) 、疏水作用色谱 (HIC) 、反相色谱 (RPC) 等都可以用来组合、构建多维液相色谱。根据对一维洗脱流分进行后续分离的连续性, 多维色谱分离可以分为离线模式 (off-line mode) 和在线模式 (on-line mode) 。Giddings指出, 多维色谱的总峰容量 (P) 等于每一维的峰容量 (Pi) 的乘积, 即:P=P1×P2×P3×…。因此从理论上可知, 多维色谱分离系统比一维色谱可提供更高的峰容量, 更适合于复杂体系的分离。 中药复方是中医防病治病的主要手段, 由多种中草药组成, 其所含成分极为复杂, 有生物碱类、苷类、香豆素类、醌类、黄酮类、萜类、有机酸类、挥发油类化合物等等。多维色谱目前主要用于蛋白质组学、生物样品、聚合物、烟草的分析, 在中药领域的应用相对较少, 特别是对中药复方的研究属于刚起步阶段。 葛根芩连汤源于《伤寒论》, 处方由葛根、甘草、黄芩、黄连组成, 具有轻清解肌、清热止痢功效, 实验研究证明葛根芩连汤具有解热、抗菌、抗病毒、解痉、抑制胃肠运动、抗缺氧、抗心律失常、降血糖和增强机体免疫功能等药理作用, 是中国传统经典的复方之一, 但由于组成复杂, 对其物质基础的研究还很不够。本文采用二维液相色谱-质谱联用 (2D-LC/MS) 平台对复方葛根芩连汤进行了研究。 1 实验部分 1.1 仪器、设备和水 LC-20 AB高效液相色谱仪, 包括LC-20 AB泵、SPD-20 A检测器、LC Solution工作站和DGU-20 A3脱气仪 (日本岛津公司) ; Agilent 1100型LC/MSD-VL型液相色谱-质谱联用仪, 包括G1379 A型在线脱气仪、G1311 A型二元高压梯度泵、G1313 A型自动进样器、G1316型柱温箱、G1314 A型紫外-可见可变波长检测器、G1956型四极杆电喷雾电离/大气压化学电离 (ESI/APCI) 质谱检测器和LC/MSD ChemStation工作站 (美国安捷伦公司) ; SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司) ;旋转蒸发器RE-52 AA (上海振捷实验设备有限公司) ; DRT-TW型调温电热套 (郑州长城科工贸有限公司) ;玻璃膜电极pH计 (Sartorius普及型) 。 葛根、黄芩、黄连、甘草饮片均购自上海市闵行区雷允上药店;甲醇、乙腈 (色谱纯, Tedia公司, USA) ;水为Milli-Q超纯水;乙酸铵、乙酸 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) 。葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱对照品购自中国生物制品检定所。 1.2 对照溶液的制备 精密称取葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱对照品适量, 分别用50%甲醇溶解并定容至5 mL, 制成0.1 g/L的对照品溶液。 1.3 从“制备”到“蒸” 按《伤寒论》处方组成及比例, 称取各单味药, 即葛根5 g、黄芩3 g、黄连3 g、甘草2 g于烧杯中, 分别加水浸泡20 min;按《伤寒论》煎煮特点“先煎葛根、后纳诸药”, 先煎葛根, 加热回流20 min;再加入其余药, 加热回流30 min后将药液倒出;加入水二次回流30 min。合并两次药液, 两次共加水500 mL;药液旋转蒸干至成浸膏, 用甲醇溶解并过滤, 定容至100 mL;于7000 r/min速率下离心10 min, 取上层清液0.5 mL, 用甲醇定容至5 mL, 0.22 μm微孔滤膜过滤, 得葛根芩连汤供试品溶液。 1.4 高效液相色谱法 采用CN柱: LC-20 AB高效液相色谱仪;色谱柱为Hypersil BDS CN柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm, 大连依利特分析仪器有限公司) ;流动相: A为100%水; B为100%甲醇;梯度洗脱: 0~10 min, 5%B~10%B; 10~50 min, 10%B~100%B; 50~70 min, 100%B;流速为1.0 mL/min;柱温为室温;紫外检测波长为270 nm;进样量为20 μL。 采用C18柱: LC-20 AB高效液相色谱仪;色谱柱为Daiso C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm, Unimicro Technologies Inc., USA) ;流动相: A为20 mmol/L乙酸铵溶液, 用乙酸调节pH至4.9; B为乙腈;梯度洗脱: 0~15 min, 10%B~15%B; 15~50 min, 15%B~25%B; 50~60 min, 25%B~30%B; 60~70 mi