细胞融合的方法过程和影响因素.pptxVIP

细胞融合的方法过程和影响因素;

细胞融合(cellfusion):又称somatichybridizationorcellhybridization,指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上得细胞通过无性方式融合形成一个杂合细胞得过程。

她能重新组合两个亲本细胞得优良遗传信息,就是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物遗传特性及创造新得符合人类需要得新得细胞系极为有效得手段。

自发融合:受精过程,成肌细胞融合,巨噬细胞融合,体外培养系统中得细胞融合

诱发融合

;1962年Okata发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体,开创

动物细胞融合得暂新领域。;;;AnOverviewofmembranefunctions;细胞融合机理

细胞融合得关键:脂双层得接触靠近,细胞桥形成,胞质渗透－细胞核融合。

;二、诱发细胞融合得方法;1、病毒促进细胞融合;HVJ促融机制:

当病毒位于两个细胞间时,病毒表面spike上神经氨酸酶降解细胞膜上得糖蛋白,使细胞膜局部聚集在病毒周围,在高pH和Ca2+条件下局部细胞膜发生融合。;2、化学融合剂促进细胞融合

1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethyleneglycol,PEG)可促进细胞融合,Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。

PEG就是一种多聚化合物,商品名卡波蜡Carbowax,分子量200－20000,靠醚键得联结使其分子末端带弱负电荷,目前已衍生达50多种。;12;聚乙二醇(PEG)介导得细胞融合;;;注意事项;3、电融合技术(Electroporation)

;;;3;注意事项;融合参数:主要包括交流电压、交变电场得振幅频率、交变电场得处理时间;直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。

;优点:;???原理:两种亲本细胞融合得混合物中可能有多种类型细胞,筛选得目得就是获得优良得杂种细胞。

???1)亲本

???2)同核体homokaryon:同源细胞融合体,她们得基因型和表现型完全一样。

???3)异核体heterokaryon:异源细胞得融合体,她们含有双亲细胞核和细胞质物质。

???4)多核体:含有双亲不同比例核物质得融合体

???5)异胞质体:具有不同胞质来源得杂合细胞。

???6)核质体:有细胞核而带有少量细胞质得亚原生质体

;动物细胞融合得筛选方式:;2)营养互补筛选系统:细胞在缺乏一种或几种营养成分时,不能生长繁??,即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。

亲本A:色氨酸缺陷型

亲本B:苏氨酸缺陷型

杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸得培养基上培养,而亲本细胞均会死亡。;3)温度敏感突变型杂种细胞得筛选:一般得培养细胞能在37度范围内生长,但温度敏感突变型得细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。

亲本一:具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。

亲本二:高温敏感突变型,但不能抗卡那霉素。

杂种细胞能在高温和含卡那霉素得培养基上生长。;4具有所需性状杂种细胞得筛选;HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立得杂种筛选;杂交瘤技术中,常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(HPRT-)骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)骨髓瘤细胞为亲本之一。

HPRT-细胞得嘌呤只能由全合成途径产生;

TK-细胞得嘧啶只能由全合成途径合成。

含氨基喋呤A培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶得全合成途径。

;基于HAT培养基得筛选系统;第三节融合细胞克隆化;通过适当得稀释达到分离单个细胞进行培养得目得

1)取出阳性孔内得细胞进行计数

2)用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。

3)如果在96孔板内每孔加0、1ml,每孔内将为一个细胞

4)加入一定数量得饲养细胞,经过8~12天后,

可观察到有集落生长得孔。

5)根据检测得阳性结果再次进行克隆化。

;

在加入饲养细胞得无菌平皿内铺上一层0、5％得琼脂,待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞得0、25％得软琼脂。待细胞长成集落后,用毛细管吸出移种于含饲养细胞得96孔板内。

;第四节杂种细胞在细胞生物学研究中得应用;2)体细胞杂种得致瘤性分析

通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞得融合来进行致瘤性得遗传分析。

3)遗传缺陷得基因互补

基于杂种细胞得基因互补作用,可分为基因间和基因内得互补作用,即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷得基因表型。通过这种基因互补,可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失得疾病。

;4)分化功能表达调控得研究

通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型得细胞构建成为能够存活得种内或种间杂种,