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实时荧光定量PCR技术的
原理、应用及实践(RealtimeQuantitativePCR)RealtimeQuantitativePCR
基本原理Companyname
基本原理CompanynameReal-timeqPCR的定量原理2Real-timeqPCR的检测方法3Real-timeqPCR的基本概念1Real-timeqPCR的解析方法4Real-timeqPCR的计算方法5
Companyname与普通PCR的比较S形曲线，具有平台效应终点检测法反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量
定量原理Companyname理想的PCR反应：X=X0*2n实际的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率
定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)Ct+logM(3)log(1+Ex)Ct=-logX0+logMCt=-klogX0+bCompanyname
Companyname每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。确定初始模板的浓度定量原理Ct=-klogX0+b
real-timeqPCR
使确定模板初始数量成为可能
11实时荧光定量PCR中的三个概念1扩增曲线(primarycurve)2荧光阈值（threshold)3CT值(CycleThreshold)
扩增曲线(primarycurve)Companyname荧光基团荧光检测元件扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光增长曲线图横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
Companyname荧光阈值（threshold)是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。阈值线原则：1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；2）同时要尽量选择进入指数期的最初阶段
CT值(CycleThreshold)CompanynameCt值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value
CompanynameCt值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性
检测方法Companyname非特异性荧光标记：SYBRGreenI特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：Molecularbeacon
17解析方法2标准曲线分析1融解曲线分析3绝对定量和相对定量
Companyname将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)Tm值确认PCR反应的特异性融解曲线分析
Companyname融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰
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