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基于前体供给增强策略的苦味酸合成工艺优化

摘要

苦味酸主要来源于啤酒花，在酿酒增味、食品防腐、抗病毒、消炎、抗肿瘤、

抗氧化等方面具有很好的应用价值。鉴于提取法和化学合成法在制备高纯度苦味酸

时具有局限性，本研究在实验室已有基础上进一步优化了微生物发酵制备苦味酸工

艺。

本研究从实验室已有的苦味酸发酵菌株和发酵工艺出发，先后进行了菌株优化

和基于前体供给增加策略的发酵工艺优化研究，提高了两种苦味酸成分蛇麻酮和葎

草酮的生物合成效率。本课题为下游合成路线提供了技术参考，有利于苦味酸工程

菌发酵的大规模工业化生产，在绿色生产的基础上有助于苦味酸活性药物的研发，

并为为苦味酸中其他成分甚至其他天然产物的合成提供了借鉴和依据。

在菌株优化工作中，本研究将苦味酸合成代谢途径中的两个异戊烯基转移酶基

因pt1和pt2进行了优化，去除了与大肠杆菌异源合成苦味酸无关的转运肽结构并以

酶融合的方式重新构建PT1/2融合酶；并与其他关键酶基因异戊二烯基焦磷酸异构

酶idi，羧基辅酶A连接酶基因ccl2，间苯三酚合酶基因vps，以及单加氧酶基因一

起构建了新的苦味酸发酵菌株。

在完成新菌株的发酵验证工作并成功分离和鉴定了苦味酸产物之后，本研究进

一步通过单因素实验确定影响苦味酸产量的发酵参数，并确定前体供给对苦味酸的

产量影响较大。在单因素基础上本研究进一步通过响应面优化法对甲羟戊酸、异戊

酸、酵母膏三个前体物的添加量进行了系统优化。响应面建模预测的最佳前体添加

量分别是甲羟戊酸10.10mL/L，异戊酸添加15.05mL/L，酵母膏补料8.80g/L。本

研究进一步通过重现性实验验证了响应面模型的准确性，在该前体添加条件下，蛇

麻酮的发酵产量在摇瓶水平达到0.85g/L，葎草酮的发酵产量在摇瓶水平达到0.50

g/L。

关键词：苦味酸；生物合成；工艺优化

I

目录

目录

前言1

1文献综述3

1.1啤酒花的简介3

1.2苦味酸的成分5

1.2.1苦味酸的组成5

1.2.2葎草酮与蛇麻酮8

1.3苦味酸的应用10

1.3.1苦味添加剂10

1.3.2抗菌抗炎10

1.3.3其它应用11

1.4苦味酸的生物合成11

1.4.1苦味酸的天然合成途径12

1.4.2苦味酸的异源生物合成瓶颈15

1.4.3苦味酸的异源生物合成设计15

1.5酶的融合研究20

1.6本课题研究设计意义与方案21

1.6.1本课题研究意义21

1.6.2本课题研究方案21

2产苦味酸的大肠杆菌工程菌株的优化23

2.1引言23

2.2实验材料23

2.3实验内容23

2.3.1PT1/2融合酶的设计与构建24

2.3.2pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt1r-linker-pt2r表达载体的设计与构建27

2.3.3pTrcHis2B-idi-monooxygenase表达载体的设计与构建28

2.3.4pTrcHis2B-idi表达载体的设计与构建29

2.4本章小结29

3前体物甲羟戊酸的生物合成31

I

目录

3.1引言31

3.2实验材料与仪器31

3.2.1试剂与仪器31

3.2.2菌株与质粒33

3.2.3实验试剂的配制33

3.3实验内容35

3.3.1产甲羟戊酸工程菌株的构建35

3.3.25L发酵罐水平制备甲羟戊酸37

3.4结果与讨论38

3.4.1BL21(DE3)工程菌株的构建38

3.4.