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高效液相色谱法测定脂质体包封率

有许多关于脂质体结合压缩率的测定方法。除了具有特定的性质（如荧光燃烧、特定的nmr信号等）外，这些药物通常首先与游离药物分离，然后测量绷带药物或绷带药物，并计算密封率105-161。分离脂质体与游离药物可采用微柱离心法、超速离心法、透析法、凝胶柱层析法、超滤法、鱼精蛋白沉淀法等31-78。微柱离心法迅速、样品用量少且几乎无稀释作用,常用于分离脂质体。但该方法必须考察脂质体洗脱程度。国内一些文献报导微柱离心法测定药物包封率多数强调将脂质体完全洗脱,而这样对于一些药物则可能无法实现与脂质体彻底分离从而影响测定。

作者以氟吡洛芬、酮洛芬、拓扑替康为模型药物制备载药脂质体,采用微柱离心去除游离药物,以HPLC法测定包封药物含量,定磷法测定磷脂检测洗脱脂质体的洗脱程度,通过药脂比测定包封率。结果表明,无需完全洗脱脂质体,可以准确测定包封率。而对于水溶性药物拓扑替康,若完全离心洗脱脂质体,则无法实现游离药物与脂质体彻底分离。因此采用微柱离心去除游离药物测定脂质体药物包封率,必须考察脂质体洗脱程度。

1试剂和仪器

Waters510液相色谱仪(美国Millipore公司),UV-VisSPD-10A紫外检测器(日本Shimazu公司),UV-9100紫外分光光度仪(北京瑞利仪器公司),80-2离心机(荣华仪器公司)。

SephadexG-50葡聚糖凝胶(中粒度,瑞典Pharmacia公司),豆磷脂酰胆碱(SPC,Epikuron200,纯度质量分数92%,德国Degussa公司),豆磷脂酰丝氨酸(SPS,Epikuron200,纯度质量分数92%,德国Degussa公司),胆固醇(CHO,生物试剂,天津博迪化工有限公司),氟吡洛芬(flurbiprofen,FBP,杭州科本化工有限公司),盐酸拓扑替康(topotecanhydrochloride,TPT,成都福润德有限公司),酮洛芬(ketoprofen,KPF,西南药物合成公司)。高氯酸(分析纯,天津东方化工厂),无水磷酸氢二钠(分析纯,北京益利精细化工有限公司),钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O,分析纯,昆山兴邦钨钼科技有限公司),1-氨基-2-萘酚-4-磺酸(分析纯,天津化学试剂一厂)。甲醇、乙腈(色谱纯,江苏汉邦),其他试剂(分析纯,市售)。

空白及载药脂质体(m(SPC)∶m(CHO)∶m(SPS)=7∶2∶1)以复乳冻干法自制,药物-脂类质量比为1∶10,水化后pH值为6.5,脂类总含量约10g·L-1,平均粒径为(221±29)nm,数量径99.6%分布在148～284nm内。

2方法和结果

2.1药物的色度分析

2.1.1水-乙腈-三氟乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸乙酸tpt

ODSC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水-乙酸酐(体积比为80∶20∶0.1)(FBF,KPF),水-乙腈-三氟乙酸(体积比为80∶20∶0.1)(TPT);流速:0.8mL·min-1(FBP,KPF),1.2mL·min-1(TPT);检验波长:247nm(FBP,KPF),228nm(TPT);柱温:40℃;进样量:20μL。

2.1.2线性关系和检出限

以体积分数为0.8的甲醇溶液精密配制药物对照品溶液,质量浓度在2.0～80.0mg·L-1内,按HPLC法检测峰面积并对质量浓度进行线性回归,得回归方程:FBP为A=1.1960×105ρ+8.1353×104(r2=1.000);KPF为A=1.4006×105ρ+1.5616×105(r2=0.9998);TPT为A=1.0068×105ρ+4.3747×103(r2=0.9993),三者对照品的质量浓度与峰面积均呈良好线性关系。

以高、中、低3种质量浓度对照品溶液,重复进样,考察精密度,日内、日间相对标准偏差RSD均小于4%。同时加入定量对照品,考察加样回收率,均在98%～101%内。

2.1.3样品测定

载药脂质体以甲醇-水(体积比为8∶2)溶液溶解,定容,按“2.1.1”条方法测定峰面积,计算药物量。

2.2采用定磷法测定了脂磷含量

2.2.1-氨基-2-磺酸亚硫酸氢钠row溶液

钼酸铵溶液:称取4.4g钼酸铵溶于1.5L纯水中,缓慢加入4mL浓硫酸,定容至2L。

Fiske-Subbarow溶液:取亚硫酸氢钠15g、亚硫酸钠0.5g,溶于100mL纯水中,加入1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.25g,在通风橱中40℃水浴避光电磁搅拌1.0～2.0h。室温下,避光静置过夜,滤除不溶物,储存于棕色试剂瓶中备用。

磷标准液(1mmol·L-1):精确称取无