核酸凝胶电泳终专业知识专家讲座.pptxVIP

什么是电泳？;凝胶电泳有几类？;核酸凝胶电泳基本原理

凝胶电泳原理比较简单。当一个带电分子放在电场当中时，它们就会以一定速度移向适当电极。带点分子在电场作用下移动速度，称之为电泳迁移率，它同电场强度和电泳分子本身携带静电荷数成正比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带静电荷越多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使用无反应活性琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质，从而将电泳分子对流运动降低到极低，使电泳分子移动速度与其分子摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质黏度函数，所以依据分子大小不一样、构型或形状差异，以及所带净电荷多寡，便能够经过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中各种成份彼此分离开来。;在生理条件下，核酸分子糖-磷酸骨架中磷酸基团，是呈离子状态。从这种意义上讲，DNA和RNA多核苷酸链可称为多聚阴离子。所以，当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正极方向迁移。因为糖-磷酸骨架在结构上重复性质，相当数量双链DNA几乎含有等量净电荷，所以它们能以一样速度向正极方向迁移。在一定电场强度，DNA分子这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核实分子本身大小和结构。分子质量较小DNA分子比分子质量较大DNA分子，含有较紧密构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子质量涣散型开环DNA分子或线性分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段基本原理。;常见电泳仪;脉冲电泳;电泳梳子;电泳仪;一·琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质一个电泳方法。对于分子量较大样品，如大分子核酸、病毒等，普通可采取孔径较大琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶含有网络结构，物质分子经过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到阻力大，所以在凝胶电泳中，带电颗粒分离不但取决于净电荷性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提升了分辨能力。凝胶分辨能力同凝胶类型和浓度相关。分辨DNA片段范围0.2~50kb；而要分辨较小分子质量DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1~1000bp。凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，??度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就越弱。;DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。因为糖-磷酸骨架在结构上重复性质，相同数量双链DNA几乎含有等量净电荷，所以它们能以一样速率向正极方向移动。;琼脂糖凝胶电泳操作;1、配胶

按所要分离DNA分子大小，称取适量琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1×TAE电泳缓冲液；

然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化成透明状，适当冷却后倒入胶托；胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽里缓冲液必须没过胶面。;铺胶;凝胶凝固后取出梳子;加缓冲液;2、EB染色

溴化乙锭是一个扁平分子，能够嵌入核酸双链配对碱基之间。在在紫外照射EB-DNA复合物时，出现不一样效应。

注意：严格区分污染区和非污染区，不把污染区物品拿到非污染区碰过EB手套要及时丢弃！;3、点样

依据样品不一样可分两种点样体系：

A、样品+6Xloadingbuffer

B、样品能够直接点样;4、电泳

点完样后连接电源，设置好电源参数，开始电泳。当溴酚蓝带（蓝色）移动至一定长度即可停顿电泳。

电压要求：≤20V/CM胶，在样品出孔用低压（3V/CM，15min）,然后调回标准电压，跑出条带很好。;成像拍照;胶图分析;注意事项;一、配胶

1.电子称使用，要时刻注意保持电子称准确性，保持清洁，依据不一样浓度胶称取琼脂糖。

2.加TAE量要适当，以防止配出来胶太薄造成胶孔太浅或浓度太低。

3.倒胶前胶托一定要洗洁净，并檫干。倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽可能不要产生气泡。若胶液温度太高胶托轻易变形。;二、EB染色

1.碰到EB手套要及时丢弃。

2.加量要适当，加EB至终浓度0.5μg/ml

3抹布要严格区分，不可交叉使用。;三、点样电泳

1.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确，排液时吸头不要有残留。

2.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。

3.点电泳前最好检验待用胶是否合格，点电泳时要对准胶孔，尽可能点完全部样。

4.点完样勿忘marker,并摆正胶位，电泳仪正负极不要插反，电泳槽盖子要盖紧。;二·聚丙烯酰胺凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳种类

1.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS）

变性聚丙烯酰胺凝胶是分子生物学惯用技术之一，是依据寡核苷酸大小来分离，所以可将全长产物与不完整短分子分开。电泳时通常每一泳道最少加1mg合成寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确寡核苷酸从凝胶上切下。主要用于单链DNA片段分离或纯化。

用途；