小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013.docVIP

细胞工程综合实验报告

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养

班级xxxx

姓名xxxx

学号xxxxxxxxxx

指导教师xxxx

实验时间xxxx

成绩

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养

姓名学号班级

实验目的

1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。

2.初步掌握培养过程中的无菌技术。

3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。

实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。

肾脏细胞:所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。

三、主要试剂

小鼠1只、PRMI1640培养基、胰蛋白酶和EDTA、PBS缓冲液、青霉素、链霉素、75%酒精、蒸馏水

仪器设备

解剖盘、镊子、剪子、手术刀、盖玻片、吸管、显微镜、无菌操作台、5ml注射器、注射针、试管、培养瓶等。二氧化碳培养箱、生物显微镜、高速冷冻离心机

、低温冰箱

五、实验步骤

5.1溶液的配置

5.2小鼠腹腔巨噬细胞原代培养

1、以颈椎脱臼法处死小鼠。

2、手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中10s，倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3min，静置5～7min。

3、置小鼠于解剖台，用针头固定四肢，在腹股沟区作一横切口，撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁，但勿伤及腹膜壁。

4、用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液。

5、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

6、小心拔出针头，把腹腔液注入离心管中。

7、将细胞悬液于4℃

8、将拧紧口的细胞培养瓶放进CO2培养箱中，然后，将瓶口松1.5圈（保证细胞呼吸），平放着混匀细胞，过夜培养。

9、第二天进行细胞换液；第三天观察细胞生长情况并拍照。

5.3肾脏细胞的原代培养

1、用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

2、点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等

3、取材

取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠入盛有75%酒精的烧杯中10秒，随即携入超净工作台内。

在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，