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山 矾 树 叶 的 物 种 鉴 定
表2-1PCR扩增引物
Table2-1PCRprimer
Region Primer Direction Sequence5-3 SourceName
ITS ITS5 f GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White1990ITS4 r TCCTCCGCTTATTGATATGC White1990
tmH-psbA psbAF f GITATGCATGAACGTAATGCTC Sangetal.1997
CGCGCATGGTGGATTCACAAT Tate Simpson
tmH2
r cc 2003
matK intF f GGAITf TCCGTCCACCCTAT RBGEdinburghintR r TIAGCCGCACATTIGAAAAA RBGEdinburgh
1.3.2.2DNA提取
总 DNA利用硅胶干燥的新鲜叶片，采用改良的 CTAB 法或使用 DNAsecurePlantKit进行提取。改良的CTAB法(58-60)提取 总 DNA :
(l) 取硅胶 干燥的叶 片约 0.4 g, 冷冻管中 加液氮 充分研 磨成粉末 ；
(2) 粉末转移 到 1.5ml 离心 管，加入650μl预热(65C）的CTAB书危基乙醇；
(3) 65.C水浴 45-60min;
(4)加入同等体积的氯仿－异戊醇 (24:l)萃取两次；5）将萃取物 移入 1.5 ml 离
心管，同时加入.4C预冷的异丙醇，沉降；
(6) 用 400 μ170％乙 醇和 无水乙 醇冲洗 DN A各一次；
(7) 待 DNA 干燥 ，加入60μITE缓冲液；
(8) 加 2％的 RNAras eA 35C水浴 !Omin。(9)保存于 4·c或－20·c备用。
1.3.2.3DNA纯度与浓度的测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280run处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/0D280
DNA浓度＝50xOD260μg/mL
PCR级DNA溶液的0D260/0D280比值应为l.7~1.9.
3.2.4PCR扩墙[GI女）
PCR 扩增反应体系为25μL, 主要包括：
IOPCRbufferMgC!i(25mM)
dNTPmixture(2.5mM)PrimerF(5μM)
PrimerR(5μM)
Taqpolymerase(5U/μL)
TemplateDNA
ITS片段的 PCR
预变性：94C 3min
变性： 94·c 30s
退火： s6·c 30s
延伸： 72C 45s
延伸： 72C 7min
2.5μL
2.5μL
2.0μLl.OμLl.OμL
0.125μLl-2μL
反应程序如下：
35cycles
trnH-psbA片段的 PCR 反应程序如下：预变性： 94·c 3min
变性： 94-C 30s
退火： 54·c 30s
延伸： n·c 30s
延伸： 72-C 7min
35cycles
matK片段的 PCR 反应程序如下：
预变性：
变性：
94·c
94·c
3min
30s
退火：
52C
30s
延伸：
72C
Imin
延伸：
72·c
7min
2.5琼脂凝胶电泳
取5μIPCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶(5V/cm)电压进行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。
3.2.6PCR产物回收和克隆测序
取剩余PCR扩增产物45μI,使用DNA产物纯化回收试剂盒纯化回收产物，进行克隆测序。测序结果利用DNAStar软件中的EditSeq进行剪接编辑，去除两端的序列，保留完整的目的基因序列用于比对。
1.3.2.7DNA序列数据的处理
根据双脱氧终止法的原理，对PCR产物进行测序。测序反应在ABIPRISM3730测序仪上完成，测序试剂为BigDyeterminatorV3.l。为保证所测序列的精确度，对大多数扩增片段进行了
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