免疫电镜技术immunoelectronmicroscopy,IEM又称为免.docxVIP

免疫电镜技术（immunoelectronmicroscopy,IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术

（immunohistochemistry）的基础上进展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方式。该方式为精准定位各类抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情形下所发生的转变提供了有效的手腕。免疫电镜技术要紧经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术和胶体金标记技术三个要紧进展时期。

铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到必然限制。

酶标记免疫电镜技术是将酶（主若是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反映后，加底物显示酶的活性部位，酶反映产物经OsO4处置变成具有必然电子密度的锇黑，可在电镜下观看。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处置的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。可是酶反映产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。

胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精准定位。胶体金要紧具有以下几个优势：（1）胶体金能稳固并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界限清楚，易于识别，定位比酶反映物更精准；（3）胶体金标记物易于制备，并能够依照需要制备大小不同（1?150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金通过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观看。另外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。

抗体的制备，标本的处置，免疫标记，对如实验、结果的观看和解析。

抗体的制备

特异性高、亲和力强的高效价抗体是取得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来取得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为经常使用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。

标本的处置

为了既能将抗原准确信位乃至定量，又能观看到近似于生活状态下的细胞超微结构，必需选择适合的固定剂，慎重处置样品。

取材

单细胞：培育细胞或血细胞应随用随取。悬浮培育细胞可先离心（800rpm,5min），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。贴壁细胞那么可先将其培育在玻片上，用PBS轻轻冲洗后当即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培育细胞的制备方式制备。

组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。假设观看的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2mmx2mmxlmm大小的组织块，切时要幸免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。

固定

固定剂常会对抗原的活性产生不同程度阻碍，为了保留细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预实验，确信固定剂的种类、浓度、温度、pH及固按时刻和方式，可用巳知效价的抗原进行实验，选择适合的固定方式。

经常使用的免疫电镜标本固定液

多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1%多聚甲醛对组织细胞的抗原性阻碍不大，假设加入超过％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到％?％时，对抗原性的阻碍便不显著，而细胞超微结构的保留也可取得专门大改善。因此推荐用1%多聚甲醛加％?％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固按时刻为4?5h。对有些抗原性较强的标本，也可采纳4%多聚甲醛加％?％戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极为灵敏，固定液只能用2?4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而阻碍其抗原性，因此在不明显阻碍抗原性的前提下，选择适合的固定浓度和时刻，尽可能强一些为宜。那个地址咱们专门推荐利用美国EMS公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，经常使用货号为157-8和16220。

过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含mol/L过碘酸钠、L赖氨酸、2%多聚甲醛及L磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一样为糖蛋白的糖类部份，使其羟基变成醛基，如此赖氨酸的双价氨基就