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基于伯乐数字PCR平台检测肺腺癌患者血液中表皮生长因子受体L858R突变

目录

TOC\o1-9\h\z\u目录 1

正文 1

文1：基于伯乐数字PCR平台检测肺腺癌患者血液中表皮生长因子受体L858R突变 2

1.样本来源及检测方法 2

1.1样本的收集 2

1.2血浆游离DNA的提取 3

1.3L858R突变检测 3

2.结果 3

2.150例肺癌患者组织及血浆游离DNAL858R突变结果 3

3.讨论 3

文2：等位基因特异性PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变 4

1材料与方法 5

1.1细胞培养 5

1.2基因组DNA制备 5

1.3AS-PCR及产物分析 5

1.4.JAK2V617F的限制性内切酶酶切鉴定 6

2结果 6

2.1.AS-PCR法检测JAK2V617F突变 6

2.2BsaXⅠ酶切分析 7

3讨论 8

原创性声明（模板） 9

正文

基于伯乐数字PCR平台检测肺腺癌患者血液中表皮生长因子受体L858R突变

文1：基于伯乐数字PCR平台检测肺腺癌患者血液中表皮生长因子受体L858R突变

肺癌位于世界癌症发病率第一位，大部分肺癌患者发现时已经位于中晚期错过了手术治疗的机会。晚期肺癌的常规治疗方法为放疗和化疗，但治疗效果往往有限，患者生存质量以及预后也较差。近年来随着分子靶向药物研究的发展，越来越多的分子靶向药物成为肿瘤治疗的另一有效手段[1]。大量研究发现部分肺癌患者肿瘤组织中存在着表皮生长因子受体的敏感突变，而络氨酸激酶抑制剂也逐渐成为了表皮生长因子受体阳性的肺癌患者重要的治疗药物[2]。表皮生长因子的敏感突变主要包括其19外显子缺失突变，L858R突变，L861Q突变，20外显子插入突变，S768I突变，以及另外的几种罕见突变[3-4]。而L858R突变几乎占表皮生长因子受体的敏感突变的50%，故对L858R突变检测具有重要临床诊疗意义。本研究对50例晚期肺腺癌患者穿刺活检组织以及匹配的外周血标本在数字PCR平台上对表皮生长因子受体L858R突变进行检测，并分析检测数据，以研究伯乐数字PCR平台在血浆游离DNA中检测L858R突变的性能。

1.样本来源及检测方法

1.1样本的收集

收集2016年2月—2018年2月期间在苏州大学附属第一医院病理科病理诊断为肺腺癌患者的活检石蜡组织50例，临床分期Ⅲ～Ⅳ期。50例样本中男性23例，女性27例。平均年龄64岁。并在治疗前采集这50例患者的外周血标本。使用10ml无创cellfreeDNA专用采血管（美国streck公司）进行外周血采集，采血后30min内进行1200g离心，离心时间为12min。吸取上层血浆转移至2ml离心管，15000g离心14min，吸取上层无悬浮物血浆进行游离DNA提取。

1.2血浆游离DNA的提取

血浆游离DNA的提取采用血清/血浆游离DNA分离试剂盒（德国qiagen公司）。DNA浓度定量使用qubit3.0（美国ThermoFishecientific公司）

1.3L858R突变检测

采用数字微滴式PCR仪QX200（美国Bio-Rod公司）及伯乐数字PCRL858R突变检测试剂盒检测标本中L858R突变。结果判读均参照说明书指示。

2.结果

2.150例肺癌患者组织及血浆游离DNAL858R突变结果

50例患者穿刺活检标本中使用数字PCR法检测到14例L858R突变阳性，36例阴性。血浆游离DNA中数字PCR法检测到11例L858R突变阳性，39例阴性。活检组织和匹配的血浆游离DNA突变检测一致率为78.57%

3.讨论

随着对肺癌诊治研究的深入，对其的治疗方法已经逐渐从单一的化疗发展到现在的分子治疗以及免疫治疗时代。络氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子受体突变的患者有着副作用小，治疗效果好等优点。对表皮生长因子的检测也逐渐成为主流的肺癌患者诊治手段。我们在50例患者血浆游离DNA标本使用数字PCR法检测到11例L858R突变阳性，39例阴性；匹配的活检组织中检测到14例L858R突变阳性，36例阴性，检测一致率达到了78.57%。这个结果显示数字PCR在血浆游离DNAL858R突变检测上已经接近了活检组织的检测结果，未来在L858R突变检测上，血浆游离DNAL858R检测可以成为一种非常有效的检测方法进行补充。而受限于病人血液质量难以控制，肿瘤不均一性，血浆游离DNA不易保存等情况，目前还达不到活检组织的检测敏感度，相信未来随着对液态活检的进一步深入以及检测工艺的改进，数字PCR在液态活检上会扮演更加重要的角色。

文2：等位基因特异性PCR联合