植物转基因技术原理及要点.ppt

第1页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三第2页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三1.技术路线目的基因分离植物表达载体的构建受体材料的准备遗传转化转化组织组织脱分化转化植株筛选炼苗第3页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三1.目的基因的分离（1）已知基因的获得①化学合成法②PCR扩增（2）未知基因的获得①构建基因组文库，筛选目的基因②构建cDNA文库，筛选目的基因③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因……第4页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①银杏叶RNA提取②反转录cDNA③chs全长cDNA的克隆④TA克隆及测序⑤向chs两端引入酶切位点⑥双酶切⑦定向克隆⑧导入农杆菌2.植物表达载体的构建第5页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三例pBI121-chs构建pBI121图谱第6页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三银杏chs基因植物表达载体构建示意图chsβ-glucuronidoseNOSterCaMV35Pchs第7页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三3.受体材料的准备细胞的全能性：分化细胞脱分化再分化第8页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三4.遗传转化（1）间接转化法——农杆菌介导转化法（2）直接转化法A、基因枪转化法B、电击法C、花粉管通道法D、PEG介导基因转化法第9页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。返回第10页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。返回第11页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力.返回第12页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.返回第13页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体.返回第14页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三表1几种植物转基因方法比较

转基因方法转化的优点转化的缺点DNA间接转化法农杆菌介导基因转移受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞DNA直接转化法（1）基因枪转化法（2）电击法（3）PEG介导基因转化法（4）花粉管通道法无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单转化效率低，需要专门设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法）第15页，讲稿共27页，2023年5月2日，星期三5.转化组织——农杆菌介导之叶盘转化法带有转化基因的农杆菌活化受体植物叶盘侵染共培养筛选培养诱导成苗预培养叶盘，或愈伤组织第16页，讲稿共