FASN通过调节“NDRG1_自噬”轴抑制骨肉瘤细胞失巢凋亡.pdf

摘要

摘要

背景与目的：

骨肉瘤(Osteosarcoma)是最常见的恶性骨肿瘤，好发于青少年及50岁左右

中年人群，骨肉瘤在初期往往症状不明显，导致约30%患者就诊时已出现肺部微

小转移，在全体患者中约50%最终会发展为转移性骨肿瘤，目前发生远处转移的

患者的预后仍然不佳。而现有治疗方案并未显著解决骨肉瘤复发率高、耐药率高

的问题，这导致部分患者最终还是难以避免远处转移的结局。因此，明确驱动骨

肉瘤转移的关键因素，探明转移发生的具体机制，是改善骨肉瘤患者预后的必经

之路。在我们前期研究中发现脂肪酸合成酶(Fattyacidsynthase,FASN)在骨肉

瘤中普遍高表达，体外实验敲低FASN可诱导骨肉瘤细胞系凋亡；在进一步的研

究中我们发现，FASN参与肿瘤远处转移过程中的重要步骤——失巢凋亡，FASN

在骨肉瘤失巢的过程中升高，同时伴随骨肉瘤细胞“失巢凋亡抵抗”能力(Anoikis

resistance,AR)增强。但是，FASN是如何介导骨肉瘤细胞AR的机制并不清楚，

本研究进一步详细阐述FASN介导骨肉瘤细胞AR，促进骨肉瘤细胞远处转移的

可能调控机制，为进一步理解骨肉瘤进展中精细分子调控过程提供新思路，为后

续新的治疗药物靶点开发提供理论依据。

方法：

1．研究FASN通过诱导自噬促进骨肉瘤细胞AR的作用：构建AR-OS细胞

株，并利用干扰慢病毒载体(Lv-shRNA)在其中分别敲低FASN，构建稳定细胞

系，通过WesternBlot、LC3双标荧光实验检测上述细胞及其亲本OS细胞株的

FASN和自噬水平；在敲低FASN的AR-OS细胞或过表达FASN的成骨细胞及

其对照细胞中利用小分子化合物氯喹(Chloroquine,CQ)及雷帕霉素

(Rapamycin,RAPA)激活/抑制自噬，通过WesternBlot、流式细胞术检测其凋亡

水平，验证FASN引起的AR能力改变是否由自噬介导。

2．研究FASN通过抑制NDRG1表达诱导骨肉瘤细胞自噬与AR：iTRAQ

蛋白组学筛选出改变FASN后影响自噬的下游基因N-myc下游调节基因1

(NDRG1)，通过WesternBlot、实时定量PCR、双荧光素酶实验研究改变FASN

II

摘要

后NDRG1变化的机制，在稳定敲低FASN的AR-OS细胞株回补NDRG1，通过

WesternBlot、LC3双标荧光实验、流式细胞术检测AR-OS细胞中NDRG1表达

水平及自噬、凋亡情况改变，验证FASN通过NDRG1调控自噬及OS细胞AR

的作用。

3．研究FASN抑制NDRG1转录的分子生物学机制：根据转录因子数据库

中自噬与失巢凋亡相关性筛选NDRG1的转录因子，通过WesternBlot、免疫共

沉淀、实时定量PCR、双荧光素酶等实验研究改变FASN后该转录因子的变化

模式及其进一步调控机制。并通过流式细胞术、肿瘤成球实验、裸鼠原位成瘤模

型肺转移实验验证调控蛋白SYVN1的功能。

结果：

1.AR-OS细胞中FASN水平上升、自噬水平提高；敲低FASN后AR-OS细

胞相比起阴性对照组的自噬水平下降，LC3双标荧光实验提示自噬流减弱。流式

细胞术检测经自噬抑制剂氯喹处理的AR-OS，结果提示凋亡细胞比例增加

(p0.05)，而在敲低FASN的稳定AR-OS中加入自噬激动剂雷帕霉素，凋亡细

胞减少(p0.01)。WesternBlot结果提示氯喹处理增加AR-OS凋亡标志蛋白水

平，在敲低FASN的稳定AR-OS中加入自噬激动剂雷帕霉素，凋亡标志蛋白水

平有所下降。流式细胞术和WesternBlot结果提示在成骨细胞中过表达FASN能

起到与雷帕霉素类似的促进细胞AR的效果，且过表达FASN的