转录因子B在乳腺癌发生过程中作用的研究.pptVIP

转录因子B在乳腺癌发生过程中作用的研究某课题组在比较正常人和乳腺癌病人乳腺细胞的基因表达谱（GeneChipArray）工作中，发现新基因B编码一个转录因子，在乳腺癌病人细胞表达缺失，如何研究该新基因B？该基因在乳腺癌细胞中缺失该基因编码一个转录因子已经拿到了基因表达谱，知道都有哪些蛋白表达与正常细胞有差异发现现象研究内容研究B基因的构成探究基因B表达缺失的原因寻找基因B编码的转录因子在信号传递过程和生物合成过程中的上下游蛋白，以及与转录因子B相互作用的蛋白探究基因B与乳腺癌的关系实验目的及实验材料实验目的：探究转录因子B在乳腺癌发生过程中的作用实验材料：人乳腺细胞HBL-100昆明系小鼠大肠杆菌B基因的构成测序blastB基因是否做过分析基因构成，内含子，外显子，重复序列及调控序列B基因的结构研究PCR扩增B基因PCR在B基因上加FLAG-tag(ATGGATTACAAGGATGACGACGATAAG)构建表达载体，转染进入大肠杆菌，扩增B转录因子破碎细胞，用FLAGresin过柱子提纯B转录因子FLAGTag蛋白质样品蛋白质晶体X射线晶体衍射谱晶体结构模型晶体电子密度基因克隆表达天然生物组织功能研究结构功能关系分析B蛋白质晶体学研究技术流程概况探究基因B表达缺失的原因表达缺失基因BmRNA蛋白DNA探针或PCRPCR无法扩增或探针检测不到基因B缺失PCR可以扩增或单针可以检测PCR可以扩增，基因表达，无法扩增得到cDNA抑制子作用增强（表达）被silenced修饰（甲基化等）测序，看剪接修饰、定位序列测序，看突变定位折叠降解连接报告基因检测纯化解结构表达谱看酶以及其他底物等有没有问题基因B及产物在信号通路中的作用上游蛋白（控制基因B转录翻译TF）相互作用蛋白（与TF相互作用控制转录）下游基因（TF结合基因）寻找上游蛋白利用调控蛋白和promoter区的结合将调控蛋白提取，纯化后质谱或者查找已知的与基因B调控序列有相似序列的基因，筛出有可能结合的调控元件，用染色质免疫沉淀技术（ChIP）进行验证后确定。ChIP在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。B转录因子相互作用的蛋白CoIP酵母双杂交，BiFC，FRETCoIP免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。寻找下游基因1.ChIP--找到转录因子结合序列测序或者将DNA片段打断让TF结合后过滤纯化，然后将TF洗脱后测序。2.blast比对（如果该基因是存在的，则下游通路已知）3.此处我们假设该基因是新基因，我们命名为geneC？