两个细胞自噬基因Barkor与Keapl的鉴定和功能分析的开题报告.docxVIP

两个细胞自噬基因Barkor与Keapl的鉴定和功能分析的开题报告

一、研究背景和意义：

自噬是维持细胞内环境平衡、细胞存活的基本机制之一，其功能异常与多种人类疾病的发生和发展密切相关。因此，对自噬通路的深入研究具有重要的理论与实践价值。其中，自噬基因Barkor和Keapl是两个维持自噬平衡的重要分子。Barkor是一个MULTI分蓝蛋白复合物成员蛋白，是自噬前体体内膜源的关键黏附分子。Keapl则通过与自噬酶ATG12结合，参与到靶向蛋白Nrf2的降解中。目前，对于Barkor和Keapl的鉴定和功能研究还相对不充分，因此，进一步明确它们的生物学特性和相互作用机制，对于揭示它们在自噬中的作用，尤其是人类疾病的发生及防治，具有重要的科学价值。

二、研究目的：

1.确定Barkor/Keapl的相互作用蛋白质，对Barkor和Keapl蛋白质复合物进行纯化、特征分析；

2.研究Barkor/Keapl的干扰对小鼠肝脏细胞自噬的影响，在自噬相关的信号转导通路中对Barkor/Keapl的作用进行验证；

3.探讨Barkor/Keapl自噬作用的分子机制和其在抗肿瘤和抗氧化应激方面的作用；

4.对于Barkor和Keapl的功能分析提供实验基础和理论研究方法，为揭示细胞自噬调控的基础机制奠定基础，并为药物靶点研究提供新思路。

三、研究方法：

1.蛋白相互作用筛选：采用酵母双杂交系统和质谱测序技术，筛选出Barkor/Keapl相互作用的蛋白质；

2.蛋白质纯化：选择目标蛋白，进行基因克隆和表达、蛋白提取、柱层析纯化等处理；

3.细胞干扰：构建Barkor和Keapl的RNAi干扰载体，在小鼠肝脏细胞中进行干扰实验；

4.蛋白、基因分析：Westernblotting和PCR分析技术检测自噬蛋白ATG12表达水平的变化；

5.细胞自噬分析：采用LC3单倍体与多倍体形态变化、Lysotracker探针染色、转染GFP-LC3表达质粒的方法，检测小鼠肝脏细胞自噬的活性变化；

6.细胞耐受性检测：细胞存活率测定、流式细胞术等实验方法，评价Barkor和Keapl在细胞药理学中的作用及其应用价值。

四、预期结果：

通过对Barkor和Keapl的相互作用蛋白质鉴定和纯化，研究它们在细胞自噬中的作用机制和生物学功能。该研究将有助于揭示一系列关于自噬调控的基本问题，拓展自噬调控的多个方面，为解决自噬相关的疾病问题提供新的实验思路。