DB65T 3597-2014生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程.docxVIP

ICS67.100.01

X16DB65

新疆维吾尔自治区地方标准

DB65/T3597—2014

生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程

PCRoftechnicalprotocolfordetectionofBrucellainrawmilk

2014-03-01发布2014-05-01实施

新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布

I

DB65/T3597—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所院提出。

本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。

本标准起草单位：新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所；新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院；新疆农业大学动物医学学院。

本标准起草人：易新萍、钟旗、高帅、姚刚、马晓菁、叶锋、谷文喜、吐尔洪·努尔、刘丽娅。

1

DB65/T3597—2014

生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程

1范围

本标准规定了检测生鲜乳中布鲁氏菌病原分离的术语、定义和缩略语、仪器、设备和试剂、生物安全措施、防污措施、检验方法的要求。

本标准适用于生鲜乳中布鲁氏菌的分离及鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB19489试验室生物安全通用要求

NY/T1467-2007奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术

SN/T1942.1-2007进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第1部分：分离与计数方法

SN/T1942.2-2007进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第2部分：PCR检验方法WS269-2007布鲁氏菌病诊断标准

WS/T230-2002临床诊断中聚合酶反应技术的应用

3术语、定义和缩略语

3.1术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1.1

布鲁氏菌(Brucella)

布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、细胞内寄生菌，为小球杆状菌，革兰氏染色阴性，能引起人和多种动物的急性和慢性感染。

3.1.2

生鲜乳(Rawmilk)

指奶畜乳房中挤出的未经任何处理的乳汁。

3.1.3

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)

聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断。

3.1.4

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DB65/T3597—2014

引物(primer)

应用化学方法合成一对与已知扩增基因片段两侧DNA序列互补的寡核苷酸，作为PCR扩增的片段。

3.1.5

模板(template)待扩增的靶DNA或RNA链。

3.2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

3.2.1PCR:聚合酶链反应

3.2.2DNA:脱氧核糖核酸

3.2.3PCRmix:聚合酶链反应混合物

3.2.4EB:溴化乙锭

3.2.5ddH?O:灭菌双蒸水

3.2.6TAE:电泳缓冲液

4仪器、设备和试剂

4.1仪器和设备

4.1.1培养皿：直径90mm

4.1.2“L”型玻璃涂布棒

4.1.3接种环：直径3mm

4.1.4天平：量程2.0kg,感量：0.1g。

4.1.5CO?培养箱及常规恒温培养箱

4.1.6灭菌处理器具：1.5mL离心管，0.2mLPCR反应管，微量移液器Tip头，50mL带盖塑料管。

4.1.7PCR扩增仪

4.1.8电泳仪

4.1.9可调微量移液器(10M-1000L)

4.1.10紫外凝胶成像仪

4.1.11显微镜

4.2试剂

4.2.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。

4.2.2布氏琼脂培养基(见附录A)。

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DB65/T3597—2014

4.2.3布鲁氏菌选择添加剂(见附录A)。

4.2.41×TAE电泳缓冲液(见附录A)。

4.2.5革兰氏染色液。

4.2.60.85%灭菌生理盐水

4.2.7PCRmix(含Taq酶、dN