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大肠杆菌表达系统课件汇报人:AA2024-01-27大肠杆菌表达系统概述基因克隆与表达载体构建大肠杆菌宿主细胞选择与培养外源基因在大肠杆菌中表达调控机制重组蛋白分离纯化方法与技术大肠杆菌表达系统优化策略与实践实验设计与数据分析方法contents目录01大肠杆菌表达系统概述定义与特点定义生长迅速遗传背景清晰表达水平高成本低廉大肠杆菌表达系统是一种利用大肠杆菌(Escherichiacoli)作为宿主细胞,通过基因工程技术将外源基因导入大肠杆菌并实现高效表达的系统。大肠杆菌繁殖周期短,培养条件简单,易于实现高密度培养。大肠杆菌的基因组较小,遗传背景相对简单,便于基因操作和表达调控。大肠杆菌表达系统可实现外源基因的高效表达,产生大量目标蛋白。大肠杆菌培养基成分简单,价格低廉,适合大规模生产和应用。发展历程及现状早期阶段发展阶段20世纪70年代,科学家开始尝试利用大肠杆菌表达外源基因,但表达效率和稳定性较低。80年代至90年代,随着基因工程技术的不断发展,大肠杆菌表达系统的效率和稳定性得到显著提高。成熟阶段现状进入21世纪,大肠杆菌表达系统已成为生物技术和生物医药领域的重要工具,广泛应用于蛋白表达、药物研发、疫苗生产等方面。目前,大肠杆菌表达系统已非常成熟,可实现多种复杂蛋白的高效表达。同时,针对特定需求,科学家们还在不断优化和改进大肠杆菌表达系统,提高其表达效率、稳定性和适用性。应用领域与前景生物医药用于生产重组蛋白、抗体、疫苗等生物医药产品。工业酶制剂利用大肠杆菌表达系统生产工业用酶,如洗涤剂酶、纺织酶等。农业生物技术应用于生产农药、抗虫蛋白等农业生物制剂。应用领域与前景环境治理用于生产生物降解塑料、重金属吸附剂等环保产品。前景随着基因编辑技术、合成生物学等前沿技术的不断发展,大肠杆菌表达系统的应用前景将更加广阔。未来,该系统有望在个性化医疗、精准治疗、生物能源等领域发挥更大作用,推动生物技术和生物医药产业的快速发展。02基因克隆与表达载体构建基因克隆技术原理010203DNA重组技术转化与转导筛选与鉴定利用限制性内切酶切割DNA片段,再通过连接酶将目的基因与载体DNA连接,形成重组DNA分子。将重组DNA分子导入大肠杆菌等受体细胞,实现基因克隆。通过选择性培养基筛选含有重组DNA分子的细胞,再通过PCR、测序等方法鉴定目的基因。表达载体类型及选择真核表达载体选择依据原核表达载体适用于大肠杆菌等原核生物,常用载体包括pET、pBAD、pCold等。适用于酵母、昆虫、哺乳动物等真核生物,常用载体包括pPIC、pFastBac、pcDNA等。根据目标蛋白性质、表达量需求、宿主细胞类型等因素选择合适的表达载体。载体构建策略与步骤转化与筛选PCR扩增以含目的基因的DNA为模板,进行PCR扩增,得到目的基因片段。将重组表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞,通过选择性培养基筛选阳性克隆。设计引物酶切与连接鉴定与测序对阳性克隆进行PCR鉴定和测序验证,确保目的基因正确插入表达载体中。根据目的基因序列设计特异性引物,用于PCR扩增目的基因。将PCR产物和表达载体分别进行双酶切,再通过连接酶将二者连接,形成重组表达载体。03大肠杆菌宿主细胞选择与培养宿主细胞类型及特性常用大肠杆菌宿主细胞类型01DH5α、BL21、JM109等不同宿主细胞的特性比较02生长速度、转化效率、蛋白表达能力等宿主细胞的选择原则03根据实验需求和目的蛋白特性选择合适的宿主细胞培养基成分及优化方法常用培养基类型LB培养基、M9培养基等培养基成分及作用碳源、氮源、无机盐、生长因子等培养基优化方法调整碳氮比、添加诱导剂或抑制剂、改变pH值等细胞培养条件与操作技巧细胞培养条件1温度、pH值、溶氧量、转速等细胞培养操作技巧2接种量控制、摇床转速选择、定期取样检测等细胞培养常见问题及解决方法3污染、生长缓慢、不表达等问题的识别与应对04外源基因在大肠杆菌中表达调控机制转录水平调控机制操纵子一组基因,共同受一个调控蛋白(阻遏蛋白或激活蛋白)的控制。启动子特定DNA序列,与RNA聚合酶结合启动转录过程。转录因子与DNA结合,影响RNA聚合酶的活性或改变DNA构象,从而调控转录过程。翻译水平调控机制翻译终止因子识别终止密码子,释放新生肽链和mRNA。翻译延长因子促进氨酰-tRNA进入核糖体A位,保证肽链的延长。翻译起始因子促进核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。蛋白质水平调控机制蛋白质修饰如磷酸化、糖基化等,可改变蛋白质活性或稳定性。蛋白质降解通过蛋白酶体等途径降解不需要或异常的蛋白质。蛋白质互作蛋白质之间通过特定结构域相互作用,形成复合物或调节彼此活性。05重组蛋白分离纯化方法与技术重组蛋白分离方法概述离心法通过离心机将细胞碎片和可溶性蛋白分离,适用于初步分离。超滤法利用超滤膜将不同分子量
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