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酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项REPORTING2023WORKSUMMARY

目录CATALOGUE酶联免疫吸附试验ELISA简介实验室环境与设备准备样品处理与加样技巧酶标板包被与封闭操作要点显色反应与终止反应操作指南结果分析与判读方法ELISA手工操作常见问题及解决方案

PART01酶联免疫吸附试验ELISA简介

利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，将待测抗原或抗体与固相载体表面的抗体或抗原结合。抗原抗体反应酶标记底物显色将酶与抗原或抗体结合，形成酶标抗原或抗体，用于后续的信号放大和检测。加入酶的底物后，酶催化底物发生显色反应，生成有色产物，通过比色法或荧光法进行定量检测。030201ELISA基本原理

用于检测各种抗原、抗体、免疫复合物等免疫学指标。免疫学检测用于研究生物活性物质的相互作用、细胞信号传导等生物医学问题。生物医学研究用于疾病的早期诊断、疗效观察和预后判断等。临床诊断ELISA应用领域

ELISA操作流程准备试剂和样本准备好所需的试剂、样本和标准品，按照说明书要求进行配制和稀释。加样将待测样本和标准品加入酶标板孔中，每孔加入相同体积的样本或标准品。孵育将酶标板置于恒温箱中孵育一定时间，使抗原抗体充分结合。

用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的抗原或抗体。洗涤每孔加入一定量的酶标抗体，再次孵育一定时间。加酶标抗体用洗涤液再次洗涤酶标板，去除未结合的酶标抗体。再次洗涤ELISA操作流程

03结果判读用酶标仪测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算待测样本的浓度。01显色每孔加入底物溶液，避光显色一定时间。02终止反应每孔加入终止液，终止显色反应。ELISA操作流程

PART02实验室环境与设备准备

温度与湿度实验室温度应保持在20-25℃，相对湿度控制在40%-60%之间，以提供稳定的实验条件。洁净度实验室应保持清洁，定期进行消毒和清洁工作，以减少污染和交叉反应的可能性。光照避免直接阳光照射，使用柔和的室内照明，以防止对实验结果的干扰。实验室环境要求

确保使用高质量的酶标仪、洗板机、恒温箱等设备，并进行定期维护和校准，以确保实验结果的准确性。设备选择高质量的试剂，并按照厂商提供的说明书进行储存和使用。特别注意检查试剂的保质期和批次一致性。试剂使用无菌、无酶的耗材，如吸头、离心管等，以避免对实验结果的干扰。耗材设备与试剂准备

实验设计样本处理试剂准备设备预热与校准实验前准备工作根据研究目的和样本特点，合理设计实验方案，包括样本数量、稀释倍数、对照设置等。根据实验方案，提前准备好所需试剂，并按照要求进行稀释和分装。注意避免试剂污染和交叉反应。按照实验要求处理样本，如血清、血浆等样本的采集、储存和稀释等步骤。提前开启酶标仪、洗板机等设备，进行预热和校准，以确保实验的顺利进行。

PART03样品处理与加样技巧

根据实验需求选择合适的样品类型，如血清、血浆、细胞培养上清等。样品类型选择使用无菌、无热原、无内毒素的收集容器，避免对实验结果造成干扰。收集容器将样品保存在适当的温度下，避免反复冻融和长时间保存，以免影响样品中抗原或抗体的活性。保存条件样品收集与保存方法

稀释比例根据实验需求和样品中抗原或抗体的浓度，确定适当的稀释比例。加样顺序按照实验设计的顺序依次加入样品、酶标试剂和底物等，避免加错或漏加。稀释液选择选择适当的稀释液，如PBS、TBS等，以保持样品的生理活性和稳定性。样品稀释及加样顺序

实验前需对实验器具进行彻底清洁和消毒，避免交叉污染。实验器具清洁操作规范空白对照和阴性对照设置孵育时间和温度控制实验过程中需严格遵守操作规范，如佩戴手套、使用一次性吸头等，避免样品间的交叉污染。设置空白对照和阴性对照，以排除非特异性反应和背景干扰，确保实验结果的准确性。严格控制样品的孵育时间和温度，避免因孵育条件不当而导致假阳性结果的出现。避免交叉污染和假阳性结果

PART04酶标板包被与封闭操作要点

0102选择合适包被缓冲液及浓度确定最佳包被浓度，通常通过棋盘滴定法确定抗原或抗体的最佳包被浓度，以获得最高的信号背景和最低的噪音。根据抗原或抗体的性质选择合适的包被缓冲液，常用的有碳酸盐缓冲液（pH9.6）和磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.4）。

包被前需将酶标板彻底清洗干净，避免残留物影响实验结果。包被时应保证每孔加入相同体积的包被液，并确保液面均匀，无气泡。包被完成后，应将酶标板置于湿盒内，避免干燥，同时防止污染。包被过程注意事项

选择合适的封闭液，常用的有1%BSA、5%脱脂奶粉等，以减少非特异性结合。封闭时间一般为1-2小时，确保充分封闭酶标板上的非特异性结合位点。封闭完成后，应彻底清洗酶标板，去除未结合的封闭液和杂质。封闭液选择及封闭时间控制

PART05显色反应与终止反应操作指南

确保显色剂的纯度和稳