DB35T 1593-2016禽坦布苏病毒病诊断技术.docxVIP

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ICS11.220

B41

DB35

福建省地方标准

DB35/T1593—2016

禽坦布苏病毒病诊断技术

DiagnostictechniquesforavianTembusuvirusinfection

2016-08-22发布 2016-11-22实施

福建省质量技术监督局发布

DB35/T1593-2016

本标准按照GB/T1.1-2009^标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给岀的规则编写。本标准由福建省农业科学院提岀。

本标准由福建省农业厅归口。

本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建岀入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、傅秋玲、白泉阳、施少华、程龙飞、陈珍、陈翠腾、陈红梅、朱春华、刘荣昌。

DB35/T1593-2016

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禽坦布苏病毒病诊断技术

1范围

本标准规定禽坦布苏病毒病的临床诊断要点和病毒核酸诊断的反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的操作技术规程。

本标准适用于禽坦布苏病毒病的临床诊断和实验室诊断。

2疫病概述

禽坦布苏病毒病在我国家禽业中，尤其是蛋鸭、种鸭中广泛流行，临床表现以高热、采食量骤降、产蛋率骤降和种（蛋）禽卵巢（卵泡）严重岀血或（和）卵黄液化为特征。该病在我国不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎为100%,病死率为。?12%。禽坦布苏病毒除主要侵害不同品种的种（蛋）鸭外，还危害肉鸭（如樱桃谷肉鸭、半番肉鸭等），临床上以共济失调、软脚、脑炎和肝脏局灶性岀血为特征。

禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属成员，为有囊膜病毒，其基因组为单股正链RNA，长度约为11kb，含有一个长度为10278bp开放阅读框，编码含3425个氨基酸的多聚蛋白，其各组成蛋白依次为5」C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3。禽坦布苏病毒在遗传进化上与黄病毒科黄病毒属可经蚊虫传播的病毒遗传进化关系较近，但禽坦布苏病毒病在冬春寒冷季节蚊虫较少时仍有发生，可通过直接接触和气溶胶传播，也有禽坦布苏病毒垂直传播的报道。

3临床诊断

3.1临床症状

当禽（尤其是种禽、蛋禽）岀现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：

a） 体温急剧升高，采食量W;

b） 产蛋率骤降；

c） 开产种（蛋）禽产蛋率上升慢、持续低产蛋率、无产蛋高峰或（和）产蛋率时高时低（适于种禽、蛋禽）；

d） 后备种（蛋）禽开产推迟或（和）产蛋不整弄。’

e） 双脚无力、共济失调或（和）双翅下垂。

3.2剖检病变

当禽（尤其是蛋禽）岀现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一：.

a） 种（蛋）禽卵巢（卵泡）岀血；

b） 种（蛋）禽卵泡内卵黄液化，卵泡变形；

c） 种（蛋）禽腹腔内积有淡红色血水或淡黄色浑浊液体；

d） 种（蛋）禽卵巢（卵泡）萎缩，卵泡数量减少；

e）肉禽肝脏局灶性岀血或（和）脑组织轻度岀血。

3.3初步诊断

当禽（包括后备种蛋禽）岀现3.1的临床症状之一或3.2中剖检病变之一时，可作岀初步诊断；需确诊，应进行实验室进一步诊断。

4反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）诊断4.1样品采集与处理

采集发病禽、濒死禽或死亡禽（尤其是种禽、蛋禽）的卵巢、肝脏、脑组织样品。将采集的组织经剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A.1）按照体积比1：4的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8000rpm离心30min，取上清冻存分装备用。

4.2主要仪器设备

主要仪器设备有：

a） PCR仪；

b） 高速台式冷冻离心机；

c） 微量移液器；

d） 组织匀浆器；

e） 电泳仪；

f） 电泳槽；

g） 紫外凝胶成像系统。

4.3试剂

采用的试剂有：

a） RNA提取试剂Trizol；

b） 三氯甲烷；

c） 异丙醇；

d） 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水：配制方法见附录A.2；

e） 75%乙醇：配制方法见附录A.?3；

f） 漠化乙锭溶液：配制方法见附录A.4；

g） IxTAE缓冲液：配制方法见附录A.5；

h） 1.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录A.6；

i） DNA相对分子质量标准物：DL2000；

j） 10*加样缓冲液：配制方法见附录A.7。

4.4引物

根据禽坦布苏病毒的非结构蛋白修基因保守区特征设计特异性引物，引物序列为，工游引物

F：5-CTAYCAYGGAAGYTACGAAGT-3（和下游引物R：5」CTTTTCT