核酸检验基本技术 .pdfVIP

第六章

第一节分子生物学基本知识

一、DNA和RNA

DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信

息。

DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。

在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。

DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。

它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中

性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。

因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。

在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。

DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。

RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递

作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。

RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地

方都代之以尿嘧啶。

二、DNA的复制和修复

细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。

DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的

单链，成为半保留复制。

在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。

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DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺

利开始DNA合成。

在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端

的羟基上。

在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加

一个正确核苷酸。

在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止

在缺失的核苷酸位置上。

在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最

主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。

该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基

酶系统不包括SⅠ核酸酶。

逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。

三、转录

在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。

它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。

合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。

大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。

四、翻译

再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。

构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。

4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺

序，遗传信息的这种转换称为翻译。

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3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一

种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。

在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的

位置。

元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖

体的五种主要的组蛋白中，一种氨基酸的tRNA与其对应，这说明合成蛋白质结

束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。

合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就

能自动折叠卷曲呈一定的空间形状。

第二节分子生物学基本技术

一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭

环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能

力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表示所携带的遗传信息。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如致病的能力和对抗生素的抗性

等。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖

和表达的工具叫载体。

细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。