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线性泛素链探针的制备与初步应用

泛素化修饰是常见的蛋白质翻译后修饰类型，是单泛素或泛素链分子在泛素激

活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的连续催化下连接到靶蛋白上的过程。

而去泛素化则是由去泛素化酶（DUB）催化将这些修饰分子从靶蛋白上水解掉的

逆反应过程。泛素是由76个氨基酸组成的分子量为8.5kDa的小蛋白质，其7个赖

氨酸位点与N端的甲硫氨酸位点均可被泛素化修饰，进而形成不同类型的泛素链分

子。一个泛素分子N端甲硫氨酸的α氨基与另一个泛素分子C端第76位甘氨酸的

α羧基连接形成的是线性泛素链，也称为M1型泛素链。本实验室前期的研究发现

线性泛素链对靶蛋白具有整链修饰的功能，为揭示参与此修饰过程的相关酶，也为

阐明相关修饰机制的研究提供实用的研究工具，本研究应用本实验室发明的新策略，

制备了线性泛素链蛋白与探针，并应用细胞内外反应进行了功能分析与实用性验证。

首先，本研究在大肠杆菌中成功表达纯化了所构建的线性泛素链探针蛋白，然

后利用Intein化学合成技术，成功制备出线性泛素链探针。所制备的探针使用Strep

TagII作为报告标签，用于分离和提取被探针捕获的酶；识别元件使用75位突变型

（G75A）、76位突变型（G76A）和野生型（WT）三种类型线性泛素链，用于介

导探针与酶的非共价互作；反应基团（也称靶向弹头）使用的是溴乙胺（Br）和

2

炔丙胺（Prg），用于探针与酶活性中心的半胱氨酸形成共价键，从而实现相关酶

的捕获与分离。同时，本研究还在HEK293T、HepG2和Hela细胞内外分析了这些

线性泛素链蛋白的修饰功能与稳定性，并应用这些细胞的裂解物验证了所制备的重

组线性泛素链探针捕获分离泛素化相关酶的实用性。

结果表明，所制备的三种类型的线性泛素链均可在细胞内发挥修饰功能，相比

WT型链，G75A型链最不稳定，而G76A型链最稳定，可以修饰更多的靶向蛋白，

此结果说明G75A突变破坏了泛素链的稳定性，而G76A突变则增强了泛素链的稳

定性，此结果还暗示，这些泛素化修饰反应过程可能还同时伴随着去泛素化的反应

过程。细胞外的互作结果显示，WT型链探针不与去泛素化酶OTULIN结合，但可

被OTULIN水解，说明所制备的WT型泛素链为天然连接，在含有特异水解酶条件

下不稳定；G75A型链探针不与OTULIN结合，更易被水解；G76A型链探针不被

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OTULIN水解，但也不与OTULIN结合，结合细胞内结果，进一步证明G75A突变

影响了泛素链的稳定性，而G76A突变则增强了泛素链的稳定性，同时说明

OTULIN属于内切酶类，泛素分子的G75和G76两保守位点对单泛素分子和泛素链

的稳定性以及OTULIN的水解活性至关重要。功能性研究发现，三种类型的线性泛

素链探针均可靶向捕获去泛素化酶UCH-L3形成共价加合物（adduct），但不与去

泛素化酶USP15互作，证明本研究制备的探针具有靶向特异性。应用HEK293T、

Hela和HepG2三种细胞系进行探针捕获酶的研究，结果发现，双泛素及四泛素长

度的WT型线性泛素链探针均可从三种细胞裂解物中捕获包括E1、E2、E3和DUB

四种酶在内的各种细胞内蛋白，但未发现两种突变型链探针与酶形成的加合物，说

明天然反应条件下，泛素C末端的两个非手性Gly位点的突变可能影响了线性泛素

链的空间结构及其非手性构象变化的灵活性，进而破坏了探针与靶酶的识别与互作。

本研究还利用LC-MS/MS