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摘要

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毒素-抗毒素系统介导持留菌形成机制的研究

持留菌(persister)是一种能在致死剂量抗生素作用下仍然存活的休眠细菌，并

且在恢复正常培养环境后，依然可以继续繁殖的表型变异菌株。近年来，越来越

多的研究者将慢性感染无法根治的问题归结于持留菌的存在。目前关于持留菌形

成机制的研究已经涉及到了很多重要的生理过程及相关基因，但由于持留菌本身

的复杂性，我们还未能完全明确其形成机制，仍然需要进一步的研究。

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系统是持留菌形成机制中比较重要的一个

部分。TA系统通常由稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素组成，根据抗毒素的性

质，可将TA系统分为六种不同的类型，其中II型TA系统与持留菌形成的关系

最为密切。在II型TA系统中，抗毒素是一种不稳定的蛋白质，在正常的生长环

境中，毒素会被抗毒素所中和。当细菌处于抗生素等压力环境下时，不稳定的抗

毒素被蛋白酶所降解，导致毒素的过表达，会影响DNA的复制、蛋白质的合成

等生理过程，从而抑制细菌的生长。由于hipA是第一个被发现与持留菌的形成

相关的TA系统基因，目前对于hipBA的研究最为广泛。

在本文中首先利用分子克隆方法构建了毒素蛋白HipA过表达质粒，并为其

引入了不同的可诱导型启动子，同时将hipA基因与红色荧光蛋白mCherry进行

融合，并且通过DNA测序对目标序列进行对比验证。通过诱导毒素蛋白过表达

对融合蛋白的毒性、荧光信号进行了检测，证明了在我们的系统中毒素蛋白的过

表达可以降低细胞的生长速度，并且在Plac-lacUV5作为启动子的系统中，存在

着随毒素蛋白的逐渐增加细胞的生长速度逐步降低的梯度效应。并且为了使系统

的毒素蛋白基底表达降低，我们还采用了改变lacI的起始密码子及其启动子的方

法，通过提高阻遏蛋白LacI的表达对这一系统进行了优化。

然后我们对毒素蛋白介导持留菌的形成机制进行了研究，我们通过调节毒素

蛋白的表达量，并对处于不同初始状态的细胞进行诱导HipA过表达，发现毒素

蛋白介导持留菌的形成依赖于细胞的初始状态。对于初始状态处于平台期的细胞，

毒素蛋白的过表达很容易影响细胞的生长速度，并且最终形成持留菌的比例也会

受到影响；但毒素蛋白的表达水平与持留菌的形成并不是呈线性相关的，当毒素

蛋白的表达水平超过某一临界值时，过量的毒素反而会导致细胞死亡，从而使得

持留率下降。而对于初始状态较为活跃的细胞，即使诱导产生同样的毒素蛋白表

达量，也仅会对细胞的生长速度产生较小的影响，而不会对持留菌的形成产生影

响。对于MG1655和DH5α两种菌株，同样的诱导条件下也会产生不同的结果。

为了进一步对该条件下持留菌的形成进行研究，我们对同样处于对数期的不同启

动子诱导的HipA过表达质粒进行了分析，发现在含有pBAD启动子的系统中，

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吉林大学硕士学位论文

由于启动子的诱导效率很高，在加入诱导剂后，细胞的生长很快便处于几乎停滞

的状态；而在需要较长时间及较高浓度的诱导剂作用下才能被诱导的Plac系统

中，则无法看到这种现象。进而对同样处于平台期的不同培养条件下的Plac系

统进行了诱导毒素蛋白过表达，发现在营养较为丰富的EZ-Rich培养基中，由于

其细胞生长速度过快，毒素蛋白无法积累，导致其很难诱导持留细胞的产生。这

一结果表明毒素蛋白介导持留菌的形成不仅与细胞的初始状态相关，还与毒素蛋

白的积累速度相关。

综上所述，本文以毒素蛋白HipA为切入点，研究了其过表达对持留菌形成

的影响，揭示了持留菌形成的一种新策略，为进一步研究持留菌的形成机制及抗

菌药物的设计提供了思路。

关键词：

持留菌，毒素-抗毒素系统，HipA，细胞初始状态

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