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授课对象：06级检验1-5班课 时：2学时
缓冲液离子强度对电泳速度的影响
目 标：1.阐述电泳的基本原理及注意事项。
初步掌握电泳技术（以血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳为例）。
观察并比较不同缓冲液离子强度对电泳速度的影响。
实验用品：电泳仪，电泳槽，醋酸纤维薄膜（2×8cm），点样器（X胶片），滤纸，无齿小镊子，pH8.6（I0.06和0.03）的巴比妥缓冲液等。
试 剂：1.I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液：
巴比妥钠 12.76g
巴比妥 1.66g
蒸馏水 1000ml
I0.03pH8.6的巴比妥缓冲液：
巴比妥钠 6.38g
巴比妥 0.83g
蒸馏水 1000ml
或用I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液加蒸馏水稀释一倍即成。
氨基黑10B染色液：
氨基黑10B冰醋酸
乙 醇蒸馏水
0.5g
10ml50ml100ml
4.漂洗液： 乙醇
45ml
冰醋酸
5.0ml
蒸馏水
50ml
实验原理：
1由于血清中各种蛋白质等电点（pI）不同，所以在同一PH8.6缓冲液中电离程度不同，因而带电荷的多少不同。再则不同蛋白质其分子大小、形状等差异，把它放入同一电场中其电泳的迁移率（是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度）不同而分离。蛋白质分子大而带电荷少的移动速度慢，如此将血清蛋白从正极到负极依次分为A、α、
1
2α、β、γ五个区带，经染色、漂洗、脱色，然后用分光光度计比色，得到各区带的D
2
值，通过D值计算出各蛋白质的相对百分含量，并可得A/G比值。
操作步骤：
一般电泳装置：示教
电泳操作：
①酸纤维薄膜的准备：在距一端 1.5cm 处用铅笔画一条细线，然后浸泡于
I0.06pH8.6的巴比妥缓冲液或I0.03pH8.6的巴比妥缓冲液中约20min。
②取出，用滤纸吸走多余的缓冲液。
③用点样器蘸取血样点于薄膜上。
④将点好样的薄膜置于电泳槽上，点样面朝下，点样端置电场中的负极。
⑤电泳：电压110~160V、时间35~40分钟。
⑥染色：氨基黑10B或丽春红S染液染色2~3分钟。
⑦漂洗：3~4次，背景变白，图象清晰。
结果观察与分析：
比较用I=0.03和I=0.06的缓冲液进行电泳时的结果，观察图形，判断用哪种离子强度好。
利用所记录的电泳电压（V），支持物有效长度（CM），电泳时间（S）和清蛋白移动距离（CM），分别计算用离子强度0.03和0.06的清蛋白迁移率，判断离子强度对电泳速度的影响。
※迁移率（μ）是指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度（V）。
即：μ=V/E=QE/6πγη（V=QE2/6πγη）∵V=D/T（CM/S）（T—时间D—移动距离cm）
E=V/L(V/cm)(V—电压 L—支持物有效长度)
∴μ=V/E=（D/T）/(V/L)=DL/VT(cm2/vs)
结论：
离子强度增加，缓冲液所载的分电流也随之增加，样品所载的分电流则降低，因此，样品的电泳速度减慢；同时离子强度增加使电泳时的总电流和产热也增加，对电
泳不利。在低离子强度时，缓冲液所载的分电流下降，样品所载的分电流增加，且介质粘度系数降低等因素，均增加了样品的电泳速度，而电泳系统总电流和产热也减少。但样品在支持物上扩散严重，分辨率明显下降，同时离子强度小，缓冲能力弱，溶液PH稳定性就差。因此，对缓冲液离子强度的选择要兼顾这两方面的因素，一般在0.05~0.10mol/L之间为好。
课后小结：
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