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实验七的定量测定—定磷法

一,原理

生物体内有许多含磷化合物，如

（RNA,）磷脂，ATP等。磷的测定方法很多，但在

生化研究中以比色法的应用最为广泛，该法量微，快

速，准确。

和核苷酸均为含鳞化合物，纯的喊磷量为

9%（RNA含磷量为8.5%--9.0%,则含9.2%的磷）。从

中测得了总磷量，就可知样品中的量，即每

测得1mg有机磷，就表示有11mg的，这就是定磷法

的理论依据

在测定过程中，浓硫酸与共热使其转变为无

机磷（此为消化过程），而无机磷与定磷试剂中的钼

酸铵在酸性条件下反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作

用下被还原成深蓝色的钼蓝（高价钼被还原成低价

钼），钼蓝在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷

浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比

生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，为了消

除无机磷的影响，应同时测定样品中的总磷量和样品

中的无机磷含量（样品消化而直接测定的含磷

量）。从总磷量中减去无机磷量，才是样品中的真正

磷含量。

核苷酸的消化和一样。此外嘌呤类核苷

酸可用1.5mol/L的HCL，100℃水解1小时脱磷；

嘧啶类核苷酸可用10mol/LH2SO4消化1—2个小

时脱磷。

二，试剂

1.标准磷试剂（含磷5μg/ml）:准确称取恒重

（105℃）的KHPO0.4389g,用水定容到100ml，此液

24

的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5μg/ml。

2.定磷试剂：

(1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（1.84）缓缓加入

83ml水中。

(2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中

(3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水中

。棕色瓶4℃贮藏。溶液应为淡，深或棕色

则不能用。

3.催化剂：硫酸铜（CuSO•5HO）：硫酸钾

42

（SO）=1：4（W/W）,研成细末。

K24

4.30%过氧化氢，浓硫酸

三，操作方法

1.制作磷标准曲线：

取标准磷酸溶液（5μg/ml）0，0.5，1.0，1.5，2.0，

2.5，3.0ml，用水补足到3ml，含磷量分别为0，2.5，5，

7.5，10，12.5，15μg，加定磷试剂3ml后摇匀，45℃

放置20分钟，测。以O含D磷量为横坐标，为

660

纵坐标制作标准曲线。

OD660

2.中总磷量的测定：

取1ml被测样品液（约含2.5—5mg，也可取固

体样品），置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催

化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄

色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至

溶液呈无色可淡蓝色为止，稍冷却，加1ml水，于100

℃加热10分钟使焦磷酸转变为磷酸。冷至室温，用蒸

馏水定容到50ml。与样品消化的同时做空白对照，空

白瓶中不加样品，用