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肿瘤基因检测样本处理
REPORTING
目录
样本采集与保存
DNA提取与纯化
基因组文库构建
基因突变检测技术应用
生物信息学分析流程
伦理、法规与标准化建设
PART
01
样本采集与保存
REPORTING
首选方法，可获得大量高质量肿瘤组织。
手术切除组织
穿刺活检
外周血
适用于无法手术切除的患者，可获得少量肿瘤组织。
适用于液体活检，可检测循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA）。
03
02
01
确保采集过程中样本不受外源DNA污染。
避免污染
确保提取到足够数量的DNA进行后续检测。
采集足量样本
记录患者姓名、性别、年龄、病理类型等信息。
标注详细信息
保存条件
一般要求-80℃以下低温保存。
保存时间
长期保存，避免反复冻融。
PART
02
DNA提取与纯化
REPORTING
酚氯仿法
经典方法，通过酚、氯仿等有机溶剂使DNA从细胞中释放出来，并进行纯化。此方法提取的DNA质量较高，但操作繁琐且有毒性。
试剂盒法
商业化试剂盒操作简便、快速，适用于大量样本处理。提取效果因试剂盒品牌及类型而异，需根据实际需求选择。
磁珠法
利用磁珠特异性吸附DNA的原理进行提取，具有高通量、自动化程度高的优点。适用于自动化工作站和大规模样本处理。
在DNA提取过程中，蛋白质可能会与DNA结合形成复合物，影响后续实验。可采用蛋白酶K消化、酚氯仿抽提等方法去除蛋白质。
去除蛋白质
RNA的存在会干扰DNA的定量和后续PCR等实验。可使用RNase酶消化RNA，或通过选择性沉淀等方法去除RNA。
去除RNA
盐分和有机溶剂的残留会影响DNA的稳定性和后续实验。可采用乙醇沉淀、透析等方法去除盐分和有机溶剂。
去除盐分和有机溶剂
通过分光光度计或荧光定量仪测定DNA浓度和纯度（A260/A280比值），确保DNA质量满足后续实验要求。
DNA浓度和纯度
通过琼脂糖凝胶电泳等方法检测DNA的完整性，观察是否有降解现象。
DNA完整性
检测样本中是否有酚、氯仿等抑制剂残留，避免对后续PCR等实验造成干扰。
无抑制剂残留
PART
03
基因组文库构建
REPORTING
基于PCR的文库构建
01
利用PCR技术扩增目标DNA片段，构建基因组文库。此方法适用于已知目标序列的特异性扩增，但可能存在扩增偏好性。
基于转座酶的文库构建
02
利用转座酶将DNA片段打断并加上接头，构建基因组文库。此方法适用于各种类型的DNA样本，且打断过程相对随机，降低了扩增偏好性。
基于杂交捕获的文库构建
03
利用特异性探针与目标DNA片段进行杂交，捕获目标片段并构建基因组文库。此方法适用于富集特定基因区域或突变位点，提高检测灵敏度。
片段大小分布
浓度测定
接头污染检查
插入片段完整性
01
02
03
04
通过生物分析仪检测文库DNA片段的大小分布，确保片段大小符合预期范围。
利用荧光定量PCR或分光光度计等方法测定文库DNA浓度，确保文库浓度满足测序要求。
通过PCR扩增接头序列，检测文库中是否存在接头污染。
通过测序数据评估插入片段的完整性，确保文库构建过程中未引入过多损伤或降解。
DNA降解
在文库构建过程中，DNA可能会因为操作不当或保存条件不佳而降解。解决方案包括优化DNA提取方法、减少操作时间、使用高质量的酶和试剂等。
文库产量低
文库产量低可能是由于起始DNA量不足、酶切效率低或PCR扩增条件不佳等原因造成的。解决方案包括增加起始DNA量、优化酶切条件和PCR扩增程序等。
接头污染
接头污染是文库构建过程中常见的问题之一，可能是由于接头序列设计不合理或连接反应条件不佳等原因造成的。解决方案包括优化接头序列设计、调整连接反应条件和使用高质量的连接酶等。
PART
04
基因突变检测技术应用
REPORTING
VS
Sanger测序法，又称为双脱氧链终止法，是一种基于DNA聚合酶和特异性引物的测序技术。在DNA合成过程中，通过掺入双脱氧核苷酸，使DNA链在某一特定碱基处终止，形成不同长度的DNA片段，然后通过高分辨率凝胶电泳分离这些片段，最终通过放射自显影读取DNA序列。
操作流程
首先设计合成特异性引物，然后进行PCR扩增，得到足够量的单链DNA模板。接着进行测序PCR反应，在反应体系中加入DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸和三磷酸腺苷（ATP），以及一种双脱氧核苷酸。通过控制双脱氧核苷酸的种类和比例，可以得到一组以A、T、C、G为终止碱基的不同长度DNA片段。最后通过高分辨率凝胶电泳分离这些片段，放射自显影后读取DNA序列。
原理
NGS（Next-GenerationSequencing）测序技术是一种高通量、高效率的测序方法，能够同时对数百万至数十亿的DNA片段进行测序。相比Sanger测序法，NGS测序
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