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大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

宋阳，王丕武，张学明,曲静

(吉林农业大学农学院，吉林长春130118)

在转基因应用中，启动子对目标基因的表达起着重要的调控作用。根据启动子的作用方式可将其分为组成型、诱导型和组织特异型3类[1]。目前组成型启动子应用最多的是CaMV35S启动子，Carlos等[2]从大豆中分离出大豆聚泛素启动子，用其启动的GFP基因的表达量比CaMV35S高2～5倍。诱导型启动子的活化受物理或化学信号刺激的诱导，能够驱动外源基因实现高效表达；其中有的诱导型启动子也有组织特异型启动子的特性，如已克隆的果实特异性表达的E8基因的启动子同时存在乙烯应答元件，故也可看作是乙烯诱导型启动子

[3]。组织特异型启动子能够驱动外源基因在特定部位和特定发育阶段表达，实现外源基因在空间和时间上的调控；现已分别在根、茎、叶、果实、花等几乎各种组织中克隆出其相应的组织特异型启动子[4-8]，并广泛应用于水稻、玉米、番茄、甘薯等诸多农作物的遗传转化研究中。目前组织特异型启动子在大

豆中的应用较为广泛，已克隆了伴大豆球蛋白、球蛋白、凝集素等大豆种子特异性启动子，并在增加转基因植物种子营养含量的研究中得到应用[9]。此外，大豆根部和种皮特异性启动子也都相继克隆成功[10-11]。豆荚特异性启动子可以增加外源基因在结荚期荚中的表达量，最大程度减少对植物其他器官的不利影响，为提高基因工程育种的精确性和安全性提供了新的元件。

大豆(Glycinemax)是我国重要的粮油兼用作物，有着极高的营养价值，是人们日常生活中必备的食用作物之一，但大豆又是一种极易受病虫害侵袭的作物[12]。目前在生产上危害较大的病虫害有大豆灰斑病、荚枯病、大豆食心虫、大豆蚜虫和豆荚螟等[13]，其中大部分为害大豆粒荚，严重影响了大豆的产量和品质，因此，针对豆荚特异性启动子控制外源基因在荚中高效表达的研究具有重要的理论和实践意义。为此,本研究利用PCR技术,根据在NCBI数据库中搜索到的豆荚特异性表达的msg基因序列，从大豆基因组DNA中分离其核心启动子片段，并将该片段与GUS报告基因重组，构建报告表达载体，转入烟草中进行功能验证，以期为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异表达奠定基础。

材料与方法

材料

供试大豆品种“吉农28”、烟草品种“NC89”、质粒pBI121、大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α)和农杆菌EHA105等，均由吉林农业大学植物生物技术中心提供。

试验试剂DNAGeLExtractionKit凝胶回收试剂盒购自V-gene公司，pMD18-TVector载体试剂盒、DNAMarkerDL2000、PCRKit购自TaKaRa公司，限制性

内切酶(HindⅢ、XbaⅠ)、T4DNALigase购自Fermentas公司，X-gal、

IPTG、X-Gluc、TritonX-100购自北京鼎国生物公司(Sigma分装)，DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitⅡ试剂盒购自Roche公司。其他试剂均为国产分析纯。

主要仪器设备有PCR仪、紫外及可见光分光光度仪、电泳仪、凝胶成像仪、低温离心机、恒温振荡培养箱、智能人工气候光照培养箱、超净工作台、超低温冰箱和高压灭菌锅等。

豆荚特异性启动子PSP片段的克隆和序列分析

取大豆品种“吉农28”的幼嫩叶片，用CTAB法[14]提取植物基因组DNA。根据NCBI上发表的大豆豆荚特异性表达基因msg(登录号：AJ239127.1)的启动子序列，用PrimerPremier5.0软件设计1对特异性引物，PSPs：5′-GGGAAGCTTCTAGATGAACTGCTTTAAGG-3′和PSPas：5′-

GGGTCTAGATCTTGAATTCAAATAATTGC-3′，其中划线部分分别为加入的HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。双酶切体系为

20μL，其中限制性内切酶HindⅢ2μL、限制性内切酶XbaⅠ1μL、质粒

5μL，Buffer2×Tango4μL，ddH2O8μL，37℃反应2h。PCR扩增体系为50μL，其中10×buffer5μL、MgCl25μL、dNPT0.8μL、50pmol/L上下游引物各2μL、模板0.1μg、Taq酶0.5μL、ddH2O32.7μL。PCR扩增条件为：94℃预变性8min；94℃变性50s，45℃退火50s，72