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Lowry-Folin法测定食品中蛋白质含量
食品学院第7组S100111029王婷
一、 实验目的：
熟悉并使用分光光度计。
学习并理解Lowry-Folin法测定食品中蛋白质含量的方法。
二、 实验原理：
在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸（Folin）试剂还原，产生深蓝色络合物。在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定蛋白质的含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的金典方法之一。
三、 实验试剂：
试剂A：称取Na2CO3100g溶于1000ml（最终体积）0.5mol/LNaoH中。
试剂B：称取CuSO4-5H2O1.0g溶于100ml（最终体积）蒸馏水中。
试剂C：称取酒石酸钾钠2.0g溶于100ml（最终体积）蒸馏水中。
牛血清蛋白（BSA）标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配成浓度为200ug/ml的溶液。
5.2mol/LFolin-酚试剂：
于2L的磨口烧瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4?2H2O）、25g钼酸钠（Na2MO4-2H2O）＞700ml蒸馏水，在加入85%磷酸溶液50ml以及浓盐酸100ml，充分混合，接上冷凝管，回流10h。回流完毕，加入150g硫酸锂、50ml蒸馏水和浓漠水（90%）数滴，开口继续煮沸15min，以除去多余的漠（冷却后如仍然有绿色需再加漠水，在煮沸）。冷却后加水定容至100ml。混匀，过滤，制的的试剂应呈金黄色，置于棕色瓶中保存。
使用时一酚酞作为指示剂，用标准溶液滴定，用蒸馏水稀释（本处为10倍），使其达到所需浓度。
四、 实验步骤：
标准曲线的绘制：
（1）取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml
血清蛋白溶液置于相应的试管中。在各支试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、
0.00ml的蒸馏水，使其总体积达到1ml。
不同浓度BSA溶液的配制
编号
0（空白）
1
2
3
4
5
BSA(ml)
0
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
水(ml)
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
BSA质量(ug)
0
40
80
120
160
200
（2） 取试剂A15.00ml,试剂B0.75ml,试剂C0.75ml,在50ml三角瓶中混匀，在每支试管中分别准确加入此试剂1.00ml，充分摇匀，静置15min。
（3） 分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液3.00ml，立即震荡，充分摇匀。
（4） 静置45min，在540nm波长下测定每个试管中也的吸光度（A值）。
（5） 以A值为纵坐标，BSA质量（0?200ug）为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数R2。
样品的测定
将啤酒样品适当稀释，吸取2份，各1.00ml，重复步骤（2）?（4）。
编号空白1
编号
空白
1
2
3
4
5
样1
样2
平均
BSA(ug)
0
40
80
120
160
200
110.12
吸光度
0.000
0.133
0.236
0.343
0.433
0.545
0.306
0.331
0.318
五、实验记录和数据处理
0.6「
0.5-
0.4-
0.3-
0.2-
0.1- A
0
0 5
当Y=0.318时，x=113.57
样品中蛋白质的含量（mg/ml）=XaXNX0.001=113.57X20X0.001=2.27
六、说明
1加入Folin-酚试剂后立即将反应摇匀，以便Folin-酚试剂在碱溶液中破坏之前即能被铜-蛋
白质复合物还原。
短时间内反应液的颜色保持稳定，因此，静置45min后反应立即测定吸光度，若拖延时间过长，颜色将会变化，影响结果。
七、思考题
1测定食品中蛋白质含量的常用方法有哪些，其原理、适用性如何。
答：（1）凯式定氮法
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
适用性：凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时试剂消耗量大。凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。
（2） Lowry-Folin法
原理：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐课产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸（Folin）试剂还
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