SN_T 3506-2013布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T3506—2013

布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程

Procedureoffluorescencepolarisationassayforbrucellosis

2013-03-01发布

2013-09-16实施

中华人民共和国

国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T3506—2013

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：王玉玲、栾慎顺、柴铭骏。

SN/T3506—2013

布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程

1范围

本标准规定了布氏杆菌病荧光偏振试验技术要求。

本标准适用于布氏杆菌病的检疫、筛查和监控。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

3生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，应由经过生物安全培训的工作人员进行布氏杆菌病的检测，应当采取

预防气溶胶感染的安全措施。所有废弃物应按照GB19489中的有关规定处置。

4试验原理

溶液中的分子作随机转动。分子的大小是影响转动速率的主要因素，与其成反比关系。因而小分子较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5°角度的转动时间即可通过测量水平和

垂直的偏振光强度来确定。因而，大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。

诊断布氏杆菌病时，布氏杆菌光滑型LPS的小分子量片段OPS(平均22kD),标记上异硫氰荧光素(FITC),用作抗原。然后加到待检血清中，若有抗体，与标记抗原结合后就会降低其转动速度，用荧

光偏振仪器测定出偏振值，通过偏振值判定样品的阴、阳性。

5试剂和材料

5.1阳性对照：布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。

5.2阴性对照；布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。

5.325×浓缩的反应缓冲液：布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。

5.4结合物：标记有异硫氰荧光素的O型多糖(OPS)抗原，布氏杆菌病荧光偏振商品化试剂。

5.596孔黑色平底微量板。

5.6除另有规定，本方法试验用水应使用符合GB/T6682规定的三级水。

6仪器和设备

6.1荧光偏振仪。

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6.2微量板振荡器。

6.3温箱：温度范围应满足16℃~26℃。

7被检样品

被检样品为血清样品。样品应避免含有颗粒物，如出现颗粒物应作离心处理。溶血样品可用于本

试验，冻干样品应用蒸馏水进行复原，冷冻样品需完全融化并混匀。

8操作方法

8.1将试剂和样品恢复至室温(16|C～26℃)。

8.2将25×浓缩反应缓冲液用蒸馏水作1:25稀释。制备稀释的反应缓冲液应避免有颗粒物，配制后的溶液放置室温保存，并在1个月两使用。

8.3取20μL阴性对照加入微量板A1、B1、C1孔中，取20L阳性对照加入微量板D1孔中，取20μl

血清样品加入其余相应孔中。在向微量板加样或加液体时应避免气泡产生。

8.4取180μL稀释的反应缓冲液加入到做量板的每个反应孔中，置振荡器上中速振荡2min,

8.5将反应板置室温(16℃~269)孵育3min～5~min-后罪英光偏振仪(激发波长485nm,发射波

8.6取10μL结合物加入到每个反应孔中，置振荡器上中速拆荡2min长528

8.6取10μL结合物加入到每个反应孔中，置振荡器上中速拆荡2min

8.7将反应板置室温(16℃~26℃5孵育-2-min~3-min,置荧光偏振使上读取最终偏振值。

9结果判定

对照或样品的偏振值计算见式(1):

FPFA-B………………(1)

式中：

FP——对照或样品的偏振值，mP;

A--—对照或样品的最终偏振值，mP;

B——对照或样品的初始偏振值，n:P。

当阳性对照的偏振值在120mP250mP之间；阴性对照的偏振值在70mP～95mP之间时，方可进行被检样品的结果判定。若阳性对照或阴性对照的偏振值超出规定的范围，需要根据仪器手册的说

明重新校正仪器。

结果判定计算见式(2):

A