动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法.docx

动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法

SN/T2980—201

5-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-3

3.2.3各探针溶液的使用浓度均为10pmal/L:

a)牛源性成分检测用探针序列及标记物为：

FAM-5-AGCATTTATAGGATACGTCC-3-MGB

b)山羊源性成分检测用探针序列及标记物为：

ROX-5-TCCTGCTCGCAACAATGGC-3-MGB

c)绵羊源性成分检测用探针序列及标记物为：

HEX-5TCCTATTTGCGACAATAGC-3-TAMRA

3.2.4各10mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸(dATP,dCTP、dGTP,dTTP)混合溶液。

3.3材料

实时荧光PCR反应管。

4仪器设备

4.1实时荧光PCR检测系统。

4.2核酸蛋白分析仪或禁外分光光度计。

4.31%电子天平。

4.4高速离心机；离心力至少达到12000g。

4.5微量移液器；0.25pL~10pL,10pL~100pL,10gL~200pL.100pL~1000pL。

4.6恒温水溶锅。

4.7微量探荡器。

4.8掌式离心机。

5样品制备

5.1饲料样品按照GB/T14699.1进行采样，将试样充分粉碎，混合均匀后待用。

5.2其他动物产品样品按照SN/T2123进行采样，将试样充分研磨，混合均匀后待用。

5.3固体样品要充分粉碎，保证颗粒大小在100目(即0.125mm)以下。

6DNA提取

6.1样品DNA提取

称取适量样品(50mg~100mg)于1.5mL离心管中，加入600pL~800pL,裂解液1(见附录A),65℃水浴30mim.每隔10min振荡混匀一次；100℃沸水浴5min;12000r/min离心5min,吸取上清液至一新离心管中，加400pL三氧甲烷十异戊醇混合液(见附录A),充分混匀；12000r/min离心5min。吸取上清液至一新离心管中.加0.8信体积的异丙醇，-20℃低温下沉淀DNA30min;12000r/min离心10min,弃去上清液；75%乙醇(见附录A)轻柔地洗涤沉淀一次，12000r/min离心8min,倒去液体，晾干；加人50μL～100pl.的TE(见附录A),充分溶解沉淀。本标准采用直接从牛、山羊和绵羊肉中提取的DNA作为阳性对照模板，因此可参照肉品的DNA提取方法进行阳性对照模板的提取，

6.2DNA浓度和纯度的测定

取5μL的DNA模板溶液加双蒸水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定

SN/T2980—2011

260nm和280nm处的吸光值A;m和A。DNA的浓度按式(1)计算：

c=A×N×50/1000 (1)

式中：

e—DNA浓度，单位为微克每微升(pg/pL);

A—260nm处的吸光值：

N——核酸稀释倍数。

当As/As比值在1.7～1.9之间时，DNA模板适宜于PCR扩增。

若检测的DNA模板浓度不在规定范围内，可适当增加样品采样量或增加PCR反应中使用的DNA模板量或减少溶解DNA的溶剂的量(浓缩模板，提高浓度),以保证检测的有效性。

7实时荧光PCR检测

7.1反应体系的总体积为50pL…,各引物溶液加2pL,牛、山羊源性检测用探针各加1.5pL,绵羊源性检测用探针加1pL,10×PCR缓冲液加5μl,,TagDNA聚合酶加1μl…样品DNA(25ng/pL.~50ng/pL)加2μL加灭菌双燕水至50μL。

7.2每种样品DNA做两个平行反应，同时设置阳性对照和阴性对照。阳性对照的设置有两种情况，可设置三管阳性对照且分别只含有牛，山羊或绵羊单一源性成分的DNA模板，也可以只设置一管阳性对照且同时加入牛、山羊和绵羊三种源性成分的DNA模板；用等体积的灭菌双蒸水代替模板DNA作为阴性对照。计算需要进行的PCR反应个数n管，按照上述成分比例配制PCR反应体系(n+1)管，然

后等份分装成n管，再依次加入DNA模板液。

7.3将加好反应液的荧光PCR反应管盖紧，快速离心5s