动物源性饲料中转基因成分实时荧光PCR检测方法.docx

动物源性饲料中转基因成分实时荧光

PCR检测方法

SN/T3496—2013

4.1.5高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。

4.1.6低温冰箱。

4.1.7纯水器，双燕水器。

4.2主要试剂

除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。

4.2.1实验用水；应符合GB/T6682中一级水的规格。

4.2.2PCR缓冲液。

4.2.3氯化镁(MgCl)。

4.2.4dNTPs(dATP.dTTP,dCTP,dGTP)。

4.2.5Tay酶。

4.2.6其他药品及试剂配制方法见附录A。

4.3引物和探针

按照表1中提供的引物及探针序列合成引物及探针(参见附录B),加入无离子水配成100pmol/pL贮存，配成直接用于PCR反应的10pmol/pL的工作液。

表1检测转基因动物内，外源基因所需的引物及探针序列

被检测基因

基因来源

物序列

探针序列

备注

牛萨融

牛内源

5-CTGCTATGTGTATGGGTTCC-3

5-GTAGAAAGACCAGTCCTTGC-3

5*-AGACAGGTCTGACTG

CTCCGATTTAATC-3

内参凰

猪2m

猪内源

3-GAAGGTTCAGGTTTACTCAOG-3

5-TCAGCAAATCAATTTCAATCTGG-3

S°-CCCAGCGGAAAACGGAAAGCCAA-3

内参凰

羊线粒体基因

羊内源

5-TTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCC-a”5*-GGGTTGTTGGATCCTGTTTOG-3

5*-CGCAGCCCTCGCCAT

AGTTCACCT-3

内参凰

SV40polyA

外源

5*TCACAAATTTCACAAATAAAGC-35-ACATGATAAGATACATTGATGAG3

5*-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCC-3

筛查检测

NPTⅡ

外源

5-TATGACTGGGCACAACAGAC-35-CGTCTTGCAGTTCATTCAGG-3’

B°-CTGCTCTGATGCCGOCGTGTTCC-2’

蜂查检测

CMV自动子

外源

5-GTTCCGCGTTACATAACTTAOGG-35*-AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG-3

5°-CCGCCTGGCTGACCGCCCAAC-3*

筛查检测

GFP

外源

5-AACCGCATCGAGCTGAAG-3

5-GTTGTGGCGGATCTTGAAG-3

5*-ACCTTGATGCCGTTCT

TCTGCTTGTCG-3

筛查检测

4.4实验步骤

4.4.1DNA提取与纯化

DNA提取与纯化按以下步骤操作：

a)取动物源性饲料0.1g,液氮研磨后转入1.5ml离心管中，加入1mL的组织裂解缓冲液，加

入蛋白酵K(20mg/mL)和胰RNA酶(20mg/mL)各5pL,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴

试剂名称

储备波浓度

25pL.反应体系加样体机/pL

50pL.反应体系加样体积/pL.

10×PCR反应缓冲液

(含MgCl)

2.5

5.0

dNTPMixture

各2.5mmol/L

2.0

4.0

引物(上游)

10pmol/L

0.5

1.0

物(下游)

10gal/l

0.5

1,0

探针

10pmol/L

2

Tag酶

5U/yl.

0.25

0.5

DNA根板

50/gL.~100ng/al

1.0-2,0

2.0-4,0

补水至

25

50

注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量。

sN/T3496-2013

sN/T3496-2013

附录B

(资料性附录)

转基因动物常用载体基因

表B.1转基因动物常用载体基因

序号

物种

载体基因

载体

参考文献

文献出处

1

猪

SV40polyA

pBlurscriptKs

FunxtionalexprekeionofaDltal2fattyaciddesaturasegenefromapinachintransgenicpig

ProeNalAcadSciUSA.200401(17):6361-636

2

猪

Pigsexpressingsalivaryphytaseproducelow-phosphorusmamure

AUGUST,2001VOLUME19

maturebi