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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T2614—2010
葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofGreeneriauvicola(Berk.Curtis)
Punithalingam
2010-05-27发布
2010-12-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
发布
SN/T2614—2010
前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局,中华人民共
和国新疆出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:杜洪忠、吴品珊、吴志毅、王文正、严进。
I
1
SN/T2614—2010
葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了进出境植物检疫中葡萄苦腐病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于进出境葡萄果实和插条中葡萄苦腐病菌的检疫和鉴定。
2原理
葡萄苦腐病菌在寄主上的症状、形态学特征及分子生物学特性是制定本标准的主要依据。
3仪器和用具
3.1仪器
生物显微镜(具测量功能),体视显微镜,超净工作台,光照生物培养箱,天平,高压灭菌器,台式高速
离心机,pH计,水浴箱,PCR扩增仪,电泳仪,凝胶成像仪。
3.2用具
烧杯,三角瓶,量简,试管,培养皿(直径9cm),载玻片,盖玻片,酒精灯,塑料研杵,移液器,移液器
吸头,离心管,液氮罐。
4试剂和培养基
4.1试剂
琼脂粉,马铃薯,葡萄糖,琼脂糖,无菌双蒸水,液氮,Ths-HCl,氮化镁,盐酸,EDTA,氢氧化钠,乙酸钠,氯化钾,Tris,CTAB,TAE,无水乙醇,苯酚,溴化乙锭(EB),三氯甲烷,异丙醇,异戊醇,蛋白酶K,TaaDNA聚合酶,dNTP,DNA分子量Marker,PCR特异性引物PMA-1和PMA-2,实时荧光PCR特
异性引物PMA-P1、PMA-P2及探针PMA-Probe-457。
4.2培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,1000mL蒸馏水,灭菌。
5鉴定方法
5.1症状检查
病害症状参见附录A。
5.2分离培养
病健交界处切取边长为5mm~10mm的样品(成熟的浆果取表皮),70%酒精消毒10s~30s,放
在PDA培养基上,24℃12h光照/12h黑暗培养1周~2周,待真菌菌落出现,再转到PDA上纯化。
2
SN/T2614—2010
5.3生物学鉴定
培养5d后观测记录菌落的颜色、分生孢子盘、分生孢子和分生孢子梗的形状大小。
5.4分子生物学鉴定
5.4.1DNA提取
按CTAB方法提取DNA见附录B。
5.4.2PCR检测
葡萄苦腐病菌的常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法见附录B。
6鉴定特征
6.1生物学特性
6.1.1病菌形态
分生孢子盘:散生或群生在寄主组织角质层或表皮下,初期埋生,成熟后外露;黑色,圆锥形或杯形,
直径80μm~250μm。
分生孢子梗:无色,有隔膜,不规则分枝,30μm×3μm。产孢细胞肠形或瓶颈型,无色光滑。
分生孢子:单胞、深色、壁薄,纺锤形到卵形,基部平,上端钝,大小为(7.5μm~10μm)×(3μm~4μm)。
病菌形态图见附录C。
6.1.2菌落特征
灰色,紧致,气生菌丝稀疏,有黑色子座产生,后期释放出深绿至黑色的分生孢子团。
6.1.3分子生物学特征
常规PCR检测结果,若在354bp处有条带,阴性与空白对照无条带出现,可判定检测结果为阳性。
实时荧光PCR检测结果,若供试样品与阳性对照的FAMCt值小于36,可判定检测结果为阳性。
7结果判定
形态学鉴定中,分离菌的形态特征与鉴定指标吻合,可判定为检出葡萄苦腐病菌。
常规PCR产物与鉴定指标吻合,可判定为葡萄苦腐病菌。
实时荧光PCR检测结果与鉴定指标吻合,可判定为葡萄苦腐病菌。
8菌种保藏
将分离菌接在PDA培养基的斜面上,待斜面表面布满菌丝后,封好斜面的盖子,置于4℃保存,每年转接复活一次。
9复核
必要时由专家对检测结果进行复核。
3
SN/T2614—2010
附录A
(资料性附录)
葡萄苦腐病菌的相关资料
A.1分类地位
英文名:Bitterrotofgrape
学名:Greeneriauvicola(Berk..Cu
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