SN_T 2614-2010葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法.docxVIP

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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T2614—2010

葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofGreeneriauvicola(Berk.Curtis)

Punithalingam

2010-05-27发布

2010-12-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

SN/T2614—2010

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局,中华人民共

和国新疆出入境检验检疫局。

本标准主要起草人:杜洪忠、吴品珊、吴志毅、王文正、严进。

I

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SN/T2614—2010

葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了进出境植物检疫中葡萄苦腐病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于进出境葡萄果实和插条中葡萄苦腐病菌的检疫和鉴定。

2原理

葡萄苦腐病菌在寄主上的症状、形态学特征及分子生物学特性是制定本标准的主要依据。

3仪器和用具

3.1仪器

生物显微镜(具测量功能),体视显微镜,超净工作台,光照生物培养箱,天平,高压灭菌器,台式高速

离心机,pH计,水浴箱,PCR扩增仪,电泳仪,凝胶成像仪。

3.2用具

烧杯,三角瓶,量简,试管,培养皿(直径9cm),载玻片,盖玻片,酒精灯,塑料研杵,移液器,移液器

吸头,离心管,液氮罐。

4试剂和培养基

4.1试剂

琼脂粉,马铃薯,葡萄糖,琼脂糖,无菌双蒸水,液氮,Ths-HCl,氮化镁,盐酸,EDTA,氢氧化钠,乙酸钠,氯化钾,Tris,CTAB,TAE,无水乙醇,苯酚,溴化乙锭(EB),三氯甲烷,异丙醇,异戊醇,蛋白酶K,TaaDNA聚合酶,dNTP,DNA分子量Marker,PCR特异性引物PMA-1和PMA-2,实时荧光PCR特

异性引物PMA-P1、PMA-P2及探针PMA-Probe-457。

4.2培养基

马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,1000mL蒸馏水,灭菌。

5鉴定方法

5.1症状检查

病害症状参见附录A。

5.2分离培养

病健交界处切取边长为5mm~10mm的样品(成熟的浆果取表皮),70%酒精消毒10s~30s,放

在PDA培养基上,24℃12h光照/12h黑暗培养1周~2周,待真菌菌落出现,再转到PDA上纯化。

2

SN/T2614—2010

5.3生物学鉴定

培养5d后观测记录菌落的颜色、分生孢子盘、分生孢子和分生孢子梗的形状大小。

5.4分子生物学鉴定

5.4.1DNA提取

按CTAB方法提取DNA见附录B。

5.4.2PCR检测

葡萄苦腐病菌的常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法见附录B。

6鉴定特征

6.1生物学特性

6.1.1病菌形态

分生孢子盘:散生或群生在寄主组织角质层或表皮下,初期埋生,成熟后外露;黑色,圆锥形或杯形,

直径80μm~250μm。

分生孢子梗:无色,有隔膜,不规则分枝,30μm×3μm。产孢细胞肠形或瓶颈型,无色光滑。

分生孢子:单胞、深色、壁薄,纺锤形到卵形,基部平,上端钝,大小为(7.5μm~10μm)×(3μm~4μm)。

病菌形态图见附录C。

6.1.2菌落特征

灰色,紧致,气生菌丝稀疏,有黑色子座产生,后期释放出深绿至黑色的分生孢子团。

6.1.3分子生物学特征

常规PCR检测结果,若在354bp处有条带,阴性与空白对照无条带出现,可判定检测结果为阳性。

实时荧光PCR检测结果,若供试样品与阳性对照的FAMCt值小于36,可判定检测结果为阳性。

7结果判定

形态学鉴定中,分离菌的形态特征与鉴定指标吻合,可判定为检出葡萄苦腐病菌。

常规PCR产物与鉴定指标吻合,可判定为葡萄苦腐病菌。

实时荧光PCR检测结果与鉴定指标吻合,可判定为葡萄苦腐病菌。

8菌种保藏

将分离菌接在PDA培养基的斜面上,待斜面表面布满菌丝后,封好斜面的盖子,置于4℃保存,每年转接复活一次。

9复核

必要时由专家对检测结果进行复核。

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SN/T2614—2010

附录A

(资料性附录)

葡萄苦腐病菌的相关资料

A.1分类地位

英文名:Bitterrotofgrape

学名:Greeneriauvicola(Berk..Cu

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