SN_T 2635-2010水稻瘤矮病毒的检疫鉴定方法.docxVIP

SN

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T2635—2010

水稻瘤矮病毒的检疫鉴定方法

Detectionandidentificationofricegalldwarfvirus

2010-05-27发布

2010-12-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

SN/T2635—2010

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫

局、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。

本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、高芳銮、朱水芳、郭琼霞、王念武、虞赟、黄可辉、吴祖建。

SN/T2635—2010

水稻瘤矮病毒的检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了水稻瘤矮病毒检疫鉴定的程序和方法。

本标准适用于水稻上水稻瘤矮病毒的检测。

2原理

水稻瘤矮病毒学名：ricegallMa-fvirms,缩写RGDV。水稻瘤矮病毒的分子生物学特性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、病毒基因组

等参见附录A。

3仪器设备、用具及试剂

3.1仪器设备

高速冷冻离心机、微量天平(171000g)、PCR仪、实时爽光PCR-仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像

分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅高压灭图附超净工作台等。

3.2用具

各种量程的可调移液器(1000L200μLμμ(2μL)、PCR反应管、无RNase离

心管(1.5mL)、研钵等。

3.3试剂

3.3.1TrizoL裂解液。

3.3.25×TBE缓冲液Tris碱54.0g

硼酸27.5g

0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL

补充蒸馏水至1L。

3.3.36×加样缓冲液

0.25%溴酚蓝

40%(质量浓度)蔗糖水溶液。

3.3.4三氯甲烷。

3.3.5异丙醇。

3.3.675%乙醇。

3.3.7无水乙醇。

3.3.8RT缓冲液。

3.3.9dNTP:10mmol/L。

2

SN/T2635—2010

3.3.10M-MLVRT:200U/μL。

3.3.11Rnasin;40U/μL。

3.3.12TaqDNA聚合酶。

3.3.13PCR缓冲液。

3.3.14氯化镁：25mmol/L。

3.3.15引物和探针：RT-PCR引物见表1,实时荧光RT-PCR引物和探针见表2。

表1RT-PCR的引物

引物名称

引物序列

产物大小

退火温度

RGDV1

5-CATTACTGTGCCGACCGAC-3’

778bp

55℃

RGDV2

5’-ACACGACCCGCCTGTTACT-3

表2实时荧光RT-PCR的引物和探针序列

引物名称

引物序列

RGDVf

5-ACTGTCGAAATTCGAACGAGGTA-3’

RGDVr

5-GGCACTCCGGTTTCAGCAT-3’

RGDV-Probe

5’-(FAM)TCCTACTCCCTTCAATCCAGCGCGA(TAMRA)-3

4检测与鉴定

4.1总RNA提取

称取0.1g样品组织，用液氮研磨成粉末状，迅速转移至灭菌的1.5mL离心管中，并加入1mLTrizoL试剂，剧烈振荡后，室温静置5min;4℃,12000g离心10min,取上清液；加入三氯甲烷200μL,剧烈振荡15s,室温静置3min;4℃,12000g离心15min,取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置5min;4℃,12000g离心10min,弃上清液；加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃,7500g离心5min,弃上清液；RNA沉淀干燥后，用20μL～40μL经DEPC(焦碳酸二乙酯)处

理过的ddH?O溶解，-20℃保存备用。

4.2cDNA合成

在PCR管中加入3μL总RNA,1μLRGDV2引物，95℃水浴7min,迅速冰浴5min。再加入下列试剂：5×RT缓冲液2.5μL、dNTP(10mmol/L)0.5μL、M-MLVR