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灌流培养工艺开发关键

1灌流速率

稳定的工艺需要适当控制培养基的补进和流出速度，即控制灌流速率。通过活细胞浓度的实时监测、稳定理想的细胞特异性灌流速率(cellspecificperfusionrate，CSPR)以及灌流速率等参数来调节细胞排出量，反应器内可维持恒定的工作体积和细胞密度。没有细胞密度在线控制系统的情况下，最常使用半连续排细胞方式控制细胞量。通过线上和线下控制系统完成连续排细胞以维持细胞密度稳定，但是线下控制水平对生产工艺性能和产品质量存在一定的影响，这种半连续方式在商业规模的生产中需谨慎使用。单位体积产率和产品质量是生物制药细胞培养过程的两个关键性能指标，通过提高单位体积产率来优化产能利用率和生产效率，同时能保持或提高产品质量。在CHO细胞生产重组人干扰素-B(B-IFN)时，低温灌流培养与批次培养相比，产率可提高3.5倍，单位体积产率提升7倍，并且可降低39%的聚集体和提高一定的生物活性。在生物反应器中进行短时间灌流，紧接着使用高浓缩补料进行常规补料分批培养，与传统补料分批工艺相比，整体产率增加近一倍。灌流反应器和四柱式周期性逆流色谱(four-columnperiodiccounter-currentchromatography，PCC)的整合系统用于连续捕获目的蛋白，比当前灌流或补料分批培养的单位体积产率高得多。

图源：Sartorius官网

2

培养基筛选

在细胞培养开发和优化过程中，培养基的开发是最重要的一个方面。一方面是因为培养基对于工艺性能而言是首要的，另一方面是出于安全考虑。第一种细胞培养基使用动物衍生制品，使用相应产品的病人将暴露于许多危险因素，如病毒等。解耦灌流培养基(即不同口流入以便能够更好地控制特定营养素和灌流速率)的概念对于培养基开发有了新的启发。使用基于补料批次培养工艺的基础培养基和浓缩补料按一定比例混合获得一种浓缩培养基，在此基础上开发出一种有效的灌流培养基。在获得最佳比例并调节一些营养物质浓度和渗透压后，获得的培养基仅需要一半的灌流速度就可维持30X106cells/曲密度。这为灌流培养基的开发提供了参考作用。

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通气效率

进行高密度细胞灌流培养时，应特别注意反应器通气系统的有效性，保证一定的氧传质率，以为培养液提供充足的氧气，反应器具有出色的氧传质率，可降低对通气的要求，这可降低尾气滤器堵塞和罐内高压的风险。同时，反应器需能及时去除高细胞密度所产生的大量的二氧化碳，以避免其抑制生产，以为对产物可能造成的负作用。另一个不能忽视的问题是，由于浓缩灌流较高的气流速率和蛋白含量，在尾气中可能会有过量的气溶胶形成，需注意降低尾气过滤器堵塞风险，提高工艺稳定性。

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批次间稳定控制关键质量属性

批量生产向连续性生产转型的驱动因素有两点，一方面是节省运营成本，更重要的是提升目的蛋白质量。在非连续生产系统中，比如批次培养和补料批次培养中，累积的有毒物质和反应副产物对目的产物的质量有不利影响。在灌流培养工艺中，在整个培养期间可维持稳定的培养环境，反应器中所有的动力学参数，包括与杂质或翻译后修饰有关的动力学参数，不会随时间变化，因此反应器内几乎产生相同产物，没有批次培养和补料批次培养的累积效应。质量属性中如半乳糖基化，非岩藻糖基化和聚体在摇管和小型生物反应器模型中是相当的，其他质量属性更多地取决于产品停留时间，例如脱酰胺，C-末端赖氨酸化和剪切等在半连续模式中是不同的。因此，灌流培养可通过减少产物在培养基内的停留时间，提高质量属性。

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代谢物控制细胞截流系统

灌流培养工艺中分离装置的稳固性对于有效分离和实现高细胞密度至关重要。在灌流培养工艺中，为了保证灌流过程中目的产物及时收获的同时不造成所培养悬浮细胞的损失，细胞截留装置成为了这项工艺必不可少的基本要素之一。

目前，用于灌流培养的细胞截留系统主要有两种，切向流过滤 (tangentialflowfiltratTFF)和交替切向流过

滤(alternativetangentialfiltratAOF)。

切向流过滤(TFF):在切向流过滤中，细胞液通过蠕动泵作用形成一个连续的环形流动方向，进入纤维膜后，废液会通过膜排出体系之外，细胞会随着环路重新回到培养体系之内。

图源：Sartorius官网

交替切向流(ATF):ATF是通过隔膜泵的往复吹吸作用，实现罐内培养基在截留设备中的往复流动，同时代谢废物会随着培养基通过膜排出而细胞截留在反应器内。使用 ATF时，交替运动在过滤膜中产生冲刷作用，

有助于防止纤维膜堵塞。并且，ATF在提高单位体积产率上也有优势，当使用ATF代替内部旋转过滤器(internalspinfilteSF)时，单位体积产率可提高